百草枯(paraquat，PQ)，是目前全球使用最广的除草剂之一，我国是目前世界生产、使用百草枯最大的国家，自杀性口服和误服是急性PQ中毒的主要原因。口服PQ中毒者的病死率高达70％～80％，成为致死性最高的农药中毒事件。PQ可经胃肠道、皮肤和呼吸道吸收，药物可随血流分布到各个脏器;其中PQ经由肺脏发达的多胺摄取系统，肺内浓度是血浆浓度的10～90倍。最具特征的毒性作用是迅速发展的弥漫性肺损害，表现为早期的急性肺损伤(acute lunginjury, ALI)，症状并进行性发展为急性呼吸窘迫综合症(acute respiratory distresssyndrome，ARDS)。如能度过一周的急性期，之后肺部损伤逐渐加重，不可逆发展为肺纤维化，后期多死于呼吸衰竭。虽然各国学者对此作了广泛深入的研究，但至今仍未完全明了PQ中毒机制，亦无有效拮抗药物。过去治疗以减少毒物吸收、增加清除为主，效果不佳;目前治疗主要以抗氧化、抗免疫反应及综合治疗为主，但效果仍欠佳。百草枯中毒治疗目前处于探索阶段，即使某些常规治疗方法也存在争议，国内外学者正致力于寻找解毒剂。随着各国学者对PQ的致病机制研究，对抗PQ中毒早期的ALI/ARDS与改善PQ中毒后期的肺纤维化成为目前PQ中毒治疗的难点、热点问题。　　在PQ中毒引起的肺损伤过程中有多种促炎及纤维化细胞因子参与，其中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target ofrapamycin，mTOR)，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，属于磷酸肌醇激酶相关蛋白激酶家族(phosphoinositide kinase-relatedkinase，PIKK)，位于PI3K/PKB(protein kinaseB，PKB)信号通路下游的一个效应蛋白。mTOR是细胞内多种重要信号传导通路的枢纽，控制着多条调节细胞生长的信号转导通路，调控翻译起始、转录、蛋白合成和降解功能，调节细胞的生存、增殖和细胞凋亡等细胞重要生理功能。mTOR还通过调节细胞周期进程控制细胞增生。p70S6K和4E-BP1为mTOR的两个经典底物，与蛋白合成有关。雷帕霉素是mTOR信号通路的特异性抑制剂，具有免疫抑制，抗炎、抗增殖作用。由于mTOR在细胞增殖、分化、转移和存活中的重要地位，mTOR可能成为肺损伤治疗中的一个新靶点。　　本研究通过百草枯灌胃染毒建立急性百草枯中毒肺损伤模型，给予雷帕霉素作为干预措施，观察百草枯中毒后肺损伤的大鼠病理、病理生理改变及氧化应激、细胞因子表达的变化及mTOR/p70S6K信号通路在百草枯中毒肺损伤的过程中的变化规律，进一步明确百草枯中毒肺损伤的机制，为临床应用雷帕霉素治疗百草枯中毒提供理论依据。　　方法:　　1、动物模型制备及分组　　108只大鼠随机分成三组:A组:对照组，B组:pQ染毒组，C组:雷帕霉素治疗组。每组分为1、3、7、14、21及28天6个亚组，每组6只。对照组，1ml生理盐水(NS)一次性灌胃，2小时后给予1ml赋形剂腹腔注射。PQ染毒组，PQ按40mg/kg用NS稀释到1ml一次性灌胃染毒，2小时后给予1ml赋形剂腹腔注射。雷帕霉素组，PQ按40mg/kg用NS稀释到1ml一次性灌胃染毒，2小时后给予雷帕霉素(2mg/kg)稀释到1ml腹腔注射。　　2、灌胃染毒　　PQ以40mg/kg计算，用NS将PQ稀释到1ml给大鼠一次性灌胃染毒。　　3、血标本收集及检测　　10％水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉、打开腹腔，腹主动脉采血6～8ml，分成2管，一管血行血气分析及肝肾功、心肌酶学检测;另一管血用于测定大鼠血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量，酶联免疫吸附法(ELISA)测定IL-6、IL-10、TNF-α。　　4、肺组织标本采集　　采血完毕后，开胸剪下整个肺脏，观察肺大体改变，结扎右肺门，取右上肺，用4％多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片，苏木素伊红(HE)、Masson染色进行肺组织病理学及SABC免疫组化观察;迅速用刀片切成约1×1×1(mm)小块，置入盛有10％戊二醛小瓶中固定，及时送至电镜室行组织超微结构检查。取右肺中叶迅速液氮中并转到-80℃冰箱冻存，用于检测羟脯氨酸(HYP)含量、免疫印迹法(Western blot)及逆转录PCR(RT-PCR)检测。取右下肺，用滤纸吸去右肺下叶血，称湿重后，置烤箱中(80℃，72h)烤至恒重，称干重，计算肺W/D比值。左肺行支气管肺泡灌洗，收集到的支气管肺泡灌洗液(BALF)冻存待测BALF中的蛋白含量。　　5、统计学处理　　采用国际统计软件SPSS16.0处理数据，所有结果用均数±标准差（(x)±s）表示，组间比较用t检验;多样本比较用单因素方差分析，如果差异具有显著性，则进行LSD-t检验。　　结果:　　1、大鼠中毒表现及体重变化　　对照组大鼠无中毒表现。染毒组大鼠在染毒后1～3天即可出现明显的中毒表现为呼吸急促、张口呼吸、口周紫绀，染毒7天以后大鼠中毒症状逐渐好转;染毒后3天体重明显下降，7天后体重开始增。雷帕霉素组，中毒症状、体征较染毒组减轻，尤其是呼吸困难明显减轻;大鼠的体重下降也不明显。　　2、大鼠动脉血气在实验中的变化　　染毒组动脉血二氧化碳(PaCO2)及氧分压(PaO2)1～28天有下降趋势，14～28天动脉血PaCO2、PaO2下降明显，与对照组及治疗组比较有统计学差异。染毒组大鼠实验后1～7天pH值略升高，14～28天动脉血pH值下降，酸中毒加重，与对照组及治疗组比较无统计学差异。染毒组大鼠实验后1～28天乳酸值逐渐升高，但与对照组及治疗组比较无统计学差异。　　3、各组大鼠肌酸激酶同工酶(CK-MB)的变化　　染毒组大鼠在染毒后1天血清CK-MB急剧上升，第3天最高，7天之后逐渐下降，21天接近对照组水平。与对照组比较，1、3、7及14天CK-MB明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。雷帕霉素治疗组1、3、7及14天时肌酸激酶同工酶较染毒组明显降低(P，＜0.05)，高于对照组(P＜0.01）。　　4、各组大鼠肺组织湿干比（W/D）的改变　　大鼠在染毒后1天W/D急剧上升，第3天最高，7天之后逐渐下降，14天接近对照组水平。与对照组比较，1、3及7天W/D含量明显升高(P＜0.01)。雷帕霉素组1、3及7天时W/D较染毒组明显降低(P＜0.05)，高于对照组(P＜0.01)。　　5、肺组织病理改变　　对照组肺泡结构正常。染毒组1～7天出现明显肺泡炎改变;7天以后炎症细胞浸润为主的肺泡炎，并伴有水肿和轻度出血;14～21天炎性改变减轻，成纤维细胞增生，肺间隔明显增宽、组织增生明显;28天病变范围弥散，出现明显的肺纤维化。雷帕霉素组，1～7天大鼠急性肺泡炎减轻，后期肺纤维化明显减轻。　　6、血清中MDA、GSH-Px、 SOD、IL-6、IL-10及TNF-α水平的变化　　(1)血清中丙二醛(MDA)水平的变化染毒组大鼠在染毒后1天血清MDA含量急剧上升，第3天时最峰，7天之后逐渐下降，14天接近对照组水平。与对照组比较，1、3及7天MDA含量明显升高(P＜0.01)。雷帕霉素组，1、3及7天时MDA较染毒组明显降低(P＜0.05)，高于对照组(P＜0.01）。　　(2)血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平的变化染毒组大鼠在染毒后1～7天血清GSH-Px活性逐渐下降，14天最低，21天后呈现逐渐上升的趋势，28天接近对照组的活性。与对照组比较，1～14天GSH-Px活性明显降低(P＜0.01)。雷帕霉素组，血清GSH-Px活力明显增加，1～14天活力较染毒组高(P＜0.05)，但低于对照组（P＜0.01）。　　(3)血清中超氧化物歧化酶(SOD)水平的变化染毒组大鼠在染毒后1天血清SOD活性急剧下降，第3天最低、7天逐渐上升但仍低于对照组，14天上升至对照组的水平。与对照组比较，1、3及7天活性明显下降，差异有统计学意义(P＜0.01)。雷帕霉素组，SOD活力明显增加，1、3及7天时SOD活力较染毒组明显升高(P＜0.05)，但低于对照组（P＜0.01）。　　(4)血清中IL-6、IL-10及TNF-α水平的变化染毒组大鼠在染毒后1天IL-6、TNF-α及IL-10含量急剧升高，第3天最高，7天后水平略有下降，14天时接近对照组水平。与对照组比较，1、3及7天含量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。雷帕霉素组1、3及7天IL-6、TNF-α及IL-10含量较染毒组明显降低(P＜0.05)，高于对照组（P＜0.01）。　　7、大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白水平变化　　染毒组大鼠在染毒后1天血清肺泡灌洗液中蛋白含量急剧上升，第7天最高峰，之后逐渐下降，14天接近对照组水平。与对照组比较，1、3及7天肺泡灌洗液中蛋白含量明显升高(P＜0.01)。雷帕霉素组1、3及7天肺泡灌洗液中蛋白含量较染毒组明显降低(P＜0.05），但高于对照组(P＜0.01)。　　8、Ashcrof评分判定肺组织纤维化　　染毒组大鼠染毒后肺组织Ashcrof评分14天迅速升高，之后肺组织Ashcrof评分逐渐升高。与对照组比较，染毒组肺组织Ashcrof评分14、21及28天明显升高(P＜0.01)。雷帕霉素治疗组，14天及以后Ashcrof评分明显高于对照组(P＜0.01)，但仍低于同时间点染毒组(P＜0.05)。　　9、肺组织羟脯氨酸(HYP)含量的变化　　染毒组大鼠染毒后肺组织HYP含量14天迅速升高，之后肺组织HYP含量逐渐升高。与对照组比较，染毒组肺组织HYP含量14、21及28天明显升高(P＜0.01)。雷帕霉素组，14天及以后HYP含量明显高于对照组(P＜0.01)，但仍低于同时间点染毒组(P＜0.05）。　　10、大鼠肺组织mTOR、p70S6K、TGF-β1、a-SMA、MMP-2及TIMP-1免疫组织化学及Western blot表达检测结果　　(1)大鼠肺组织mTOR及p70S6K表达变化对照组:大鼠肺组织中即有少量mTOR、p70S6K表达。染毒组:染毒后3天肺组织中mTOR、p70S6K表达略增强，第14天时最高，以后维持在较高水平，至28天时仍明显高于对照组(P＜0.01)。雷帕霉素组:肺组织中mTOR、p70S6K表达明显减弱，在3～28天，与染毒组比较均有统计学意义(P＜0.05)，与对照组比较均高于对照组(P＜0.01)。　　(2)大鼠肺组织MMP-2及TIMP-1表达的变化对照组:大鼠肺组织中仅有少量MMP-2及TIMP-1的表达。染毒组:大鼠肺组织中MMP-2的表达从1天就明显增强，第14天时最高此后开始下降，直至染毒后21天仍明显强于对照组(P＜0.01)，28天以后与对照组相比无统计学差异。TIMP-1的表达从1天就明显增强，第21天最高，以后持续维持较高水平，至28天仍明显高于对照组(P＜0.01)。雷帕霉素组:肺组织中MMP-2明显减弱，在1～21天，与染毒组比较(P＜0.05)，与对照组比较均高于对照组(P＜0.01)。肺组织中TIMP-1明显减弱，在1～28天，与染毒组比较均有统计学意义(P＜0.05)，与对照组比较均高于对照组（P＜0.01）。雷帕霉素干预后矫正MMP-2/TIMP-1不平衡比例，特别在第14及21天。　　(3)肺组织TGF-β1及a-SMA表达的变化对照组:大鼠肺组织中即有少量TGF-β1及a-SMA的表达。染毒组:染毒后7天肺组织中TGF-β1及a-SMA蛋白表达即明显增强，第14天最高，以后维持在较高水平，至28天仍明显高于对照组(P＜0.01)。雷帕霉素组:肺组织中TGF-β1及a-SMA蛋白明显减弱，在7～28天，与染毒组比较均有统计学意义(P＜0.05)，与对照组比较均高于对照组(P＜0.01)。　　11、肺组织mTOR、p70S6K、CollagenⅠ及TGF-β1mRNA的变化　　(1)肺组织mTOR及p70S6K mRNA的变化对照组:大鼠肺组织中即有少量mTOR及p70S6K mRNA表达。染毒组:染毒后3天肺组织中mTOR及p70S6KmRNA表达略增强，第14天最高，至28天时仍明显高于对照组(P＜0.01)。雷帕霉素组:肺组织中mTOR及p70S6K mRNA明显减弱，在3～28天，与染毒组比较均有统计学意义(P＜0.05），与对照组比较均高于对照组(P＜0.01)。　　(2)肺组织TGF-β1及CollagenⅠ mRNA的变化对照组:大鼠肺组织中即有少量TGF-β1、 CollagenⅠ mRNA表达。染毒组:大鼠肺组织中TGF-β1、 CollagenⅠmRNA表达从7天就明显增强(P＜0.05)，第14天最高，至28天时仍明显高于对照组(P＜0.01)。雷帕霉素组:肺组织中TGF-β1、 CollagenⅠ mRNA明显减弱，在7～28天，与染毒组比较均有统计学意义(P＜0.05)，与对照组比较高于对照组(P＜0.01)。　　结论:　　1、百草枯中毒引起的肺损伤主要表现为1～7天的急性肺泡炎和14天以后逐渐进展的肺间质纤维化。血中百草枯浓度高峰比出现明显中毒症状时间要早，因此要早期检测血中百草枯浓度。　　2、百草枯中毒大鼠体内MDA含量升高、SOD及GSH-Px活力下降，说明PQ可引起过氧化损伤及肺内氧化一抗氧化系统失衡，进而产生肺内炎性反应是造成急性肺损伤的主要机制之一。　　3、促炎和抗炎细胞因子在百草枯中毒肺损伤中起关键作用，促炎细胞因子过度表达和抗炎细胞因子相对不足导致失控的炎性反应与ALI发生发展密切相关。TNF-α与IL-10的比值可影响ALI炎症的程度和走向，因此改善体内促炎和抗炎细胞因子平衡，可能成为治疗百草枯中毒肺损伤的重要手段。　　4、百草枯中毒致急性肺损伤后，肺内MMP-2及TIMP-1的表达不同步造成ECM合成和降解不平衡，从而诱导肺纤维化形成。　　5、氧化应激作为主要的诱导因素之一，引起mTOR/p70S6K信号通路活化。它作为细胞因子网络调控的枢纽环节，活化后引起细胞因子调控失衡，mTOR、p70S6K、TNF-α及IL-6在中毒早期表达就增强，可能在肺泡炎阶段起重要作用;而mTOR、p70S6K、α-SMA、TGF-β1及CollagenⅠ在中毒后期仍维持高水平，与TIMPs的变化一致，可能在纤维化形成过程中发挥更为关键的作用，提示mTOR/p70S6K信号通路在百草枯肺损伤的过程中发挥双重的调控作用。　　6、本研究提出mTOR信号通路参与百草枯中毒致肺损伤的过程，并验证雷帕霉素可抑制mTOR活性，从而阻断了mTOR/p70S6K信号通路，可调控肺内氧化一抗氧化系统失衡，改善体内促炎和抗炎细胞因子平衡，调控胶原蛋白的合成与稳定，调节MMPs和TIMPs之间的平衡，并与TGF-β信号通路相互作用，影响细胞外基质的产生来减轻百草枯中毒致肺损伤的过程。