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目的:1.探讨肝硬化并发门静脉血栓的危险因素及中医证候特点。2.采用门静脉主干部分结扎复合CCl4腹腔注射的造模方法,建立肝硬化门静脉血栓大鼠动物模型。3.观察当归补血汤对肝硬化门静脉大鼠动物模型的治疗效果及量效关系。方法:1.收集上海中医药大学附属曙光医院肝二病区肝硬化住院患者,根据相应纳排标准,采集相关病史资料,实验室及辅助检查报告,对照组纳入Child评分同级别的肝硬化患者,建立临床信息数据库。将两组患者进行临床资料比较,分析肝硬化并发门静脉血栓的危险因素及独立危险因素,基于肝硬化并发门静脉血栓患者的临床信息表达频数分析其证候特点。2.通过门静脉主干部分结扎复合CCl4腹腔注射的造模方法,诱导肝硬化门静脉血栓的大鼠动物模型。观察、比较大鼠动物模型动态时间点4周、6周、8周和10周的一般情况,包括肝/体比、脾/体比的变化;肝组织HE染色及血清ALT、AST检测,观察肝组织炎症水平;天狼猩红染色及羟脯氨酸含量测定,观察肝组织胶原沉积及肝纤维化、肝硬化;血清凝血酶原时间、INR、凝血酶原活动度、活化部分凝血活酶时间、纤维蛋白原、D-二聚体、抗凝血酶Ⅲ和血小板的检测,评估大鼠动物模型凝血功能变化;超声方法检测大鼠动物模型门静脉主干内径及血流速度;通过肉眼观察解剖后大鼠门静脉,及门静脉HE染色和肝组织Fibrinogen免疫组化染色的方法,评估大鼠动物模型门静脉血栓形成情况。3.当归补血汤对门静脉主干部分结扎复合CCl4腹腔注射诱导的肝硬化门静脉血栓大鼠动物模型的治疗作用,量效关系及作用机制。比较正常组,模型组,当归补血汤低、高剂量组,及阳性药对照组大鼠动物模型的一般情况,包括体重、肝/体比、脾/体比的变化;肝组织HE染色及血清ALT、AST检测,观察肝组织炎症水平的变化;天狼猩红染色,观察肝组织胶原沉积及肝纤维化、肝硬化的改善情况;血清凝血酶原时间、INR、凝血酶原活动度、活化部分凝血活酶时间、纤维蛋白原、D-二聚体、抗凝血酶Ⅲ和血小板的检测,评估大鼠动物模型凝血功能的变化;超声方法检测大鼠动物模型门静脉主干内径及血流速度的变化;免疫荧光及蛋白印迹法检测肝组织vWF、eNOS、Rab3B、Rab27A蛋白表达,评价内皮细胞功能。结果:1.收集肝硬化患者126例,其中并发门静脉血栓的患者62例。单因素分析结果显示,并发门静脉血栓组与无门静脉血栓组患者在胆碱酯酶、纤维蛋白降解产物、D二聚体、中性粒细胞百分比、门静脉主干内径、门静脉主干流速、脾静脉内径、脾脏厚径、脾脏长径、腹腔积液量方面差异均具有统计学意义(均P<0.05);Logistic 回归分析结果显示,D-二聚体(OR=2.078,95%CI 1.293-3.339,P=0.003)、脾脏长径(OR=1.964,95%CI 1.228-3.142,P=0.005)是肝硬化并发门静脉血栓的独立危险因素;乏力、脾大、腹胀、食管胃静脉曲张重度、静脉曲张出血史、舌淡红、脉弦/细是肝硬化并发门静脉血栓患者的主要特征,符合气虚血瘀证表现。2.门静脉主干部分结扎复合CCl4腹腔注射诱导的肝硬化门静脉血栓大鼠动物模型动态时间点观察。生化结果:各复合模型血清肝功能ALT、AST显著升高;10周模型组与各模型组比,均不同程度升高。各复合模型肝组织羟脯氨酸含量逐渐增长,肝纤维化的严重程度逐渐加重,10周模型组最显著。肝组织HE染色:单纯结扎组汇管区胆管增生。复合模型大鼠肝组织随着造模时间的延长纤维间隔形成,10周模型纤维间隔增多增厚,可见大量胆管上皮细胞、炎性细胞浸润,个别形成肉芽肿。天狼猩红染色:单纯结扎组中央静脉血管壁增厚。复合模型组大鼠,随着造模时间的延长,中央静脉血管壁胶原逐渐增粗,汇管区的胶原纤维沉积也逐渐增多,出现汇管区与汇管区的联合,10周模型可见胶原纤维包绕成团形成多个纤维间隔。凝血酶原时间:6周和10周模型显著升高;INR:6周和10周模型显著下降;凝血酶原活动度:各模型组均显著下降。活化部分凝血活酶时间:10周模型显著升高。纤维蛋白原:10周模型组显著下降。D-二聚体:10周模型组显著下降。抗凝血酶Ⅲ:4周、6周、10周模型组显著下降。血小板:6周模型组下降,其余模型组均有下降趋势。门静脉主干内径及流速:10周模型组主干内径显著缩窄;各复合模型组流速显著减慢。3.当归补血汤对门静脉主干部分结扎复合CCl4腹腔注射诱导的肝硬化门静脉血栓大鼠动物模型药效及量效关系。生化结果:当归补血汤高剂量组与利伐沙班组ALT降低。当归补血汤高剂量组和阳性药对照组羟脯氨酸含量有下降的趋势,当归补血汤高剂量组降幅最大。肝组织HE染色:当归补血汤高剂量组炎症反应明显减轻,无明显胆管增生反应,中央静脉管腔明显缩小,管壁增厚明显改善;利伐沙班组炎症、胆管增生反应减轻。天狼猩红染色:当归补血汤低剂量组纤维间隔胶原沉积无明显减轻,高剂量组纤维增生明显减轻,纤维间隔不完全,利伐沙班组纤维间隔胶原沉积减轻。凝血酶原时间:各治疗组均显著缩短。INR:各治疗组均显著缩短。凝血酶原活动度:各治疗组均显著升高。活化部分凝血活酶时间:利伐沙班组与当归补血汤低剂量组、当归补血汤高剂量组相比降低。纤维蛋白原:各治疗组有降低的趋势。D-二聚体:各治疗组有降低的趋势。抗凝血酶Ⅲ:当归补血汤高剂量组、利伐沙班组显著升高。血小板:各治疗组有升高的趋势。门静脉主干内径及流速:各治疗组内径明显增宽,当归补血汤低剂量组流速增块。免疫荧光结果显示:各治疗组肝组织vWF表达量显著下降,当归补血汤高剂量组较低剂量组更低。蛋白印迹结果显示:当归补血汤高剂量组、利伐沙班组肝组织eNOS表达量显著增加;各治疗组肝组织Rab3B表达量显著降低;当归补血汤高剂量组较低剂量组显著降低。与当归补血汤低剂量组相比,高剂量组肝组织Rab27A表达量减少。结论:1.D-二聚体、脾脏长径是肝硬化门静脉血栓的独立危险因素;肝硬化门静脉血栓患者符合“气虚血瘀”证候特点。2.门静脉主干部分结扎复合CCl4诱导的大鼠动物模型,在CC14染毒10周时,出现肝硬化及门静脉血栓。3.当归补血汤具有减轻肝内炎症反应、抗纤维化,抑制凝血功能及溶解血栓的作用,且高剂量组优于低剂量组,该作用可能与保护内皮细胞损伤有关。