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牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus,BRSV)是副黏病毒科、肺病毒亚科、肺病毒属的成员,为有囊膜病毒,其基因组是负链RNA,全长约15000 nt,可转录出10条病毒RNA,并翻译成11种蛋白质,其中9种为结构蛋白、2种为非结构蛋白。BRSV呈世界性分布,在我国的流行也比较普遍。BRSV感染牛如果继发性细菌感染,呼吸系统疾病会更加复杂,是发病牛高度死亡的主要原因,给养牛业带来了巨大的经济损失。疫苗免疫仍是防控该病的有力手段。基于反向遗传技术的病毒基因结构与功能的研究,是揭示BRSV致病机理、免疫保护机制以及病毒的宿主和组织嗜性等相关研究的基础。本研究以BRSV核酸呈阳性的鼻拭子样品LJX31为材料,对BRSV全长基因组进行序列测定,并进行序列同源性及进化树分析,以确定中国流行的BRSV的遗传进化关系。在此基础上构建BRSV反向遗传质粒系统,可用于BRSV反向遗传系统的建立,为BRSV的结构与功能研究奠定基础。全长基因组序列测定和分析结果显示,LJX31全长基因组为15150 nt,5’端非编码区为45 nt,3’端非编码区为161 nt。基因组的编码区位于46-14989 nt,包括NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2和L基因。L基因最大,含有6573 nt;NS2基因最小,含有492 nt;NS1、N、P、M、SH、G、F和M2基因全长依次为527、492、1202、869、950、466、840、1902和960 nt。全长基因组序列比对分析显示,LJX31与美国Atue51908株的同源性为96.4%。LJX31的全长基因组存在13个核苷酸的插入和3个核苷酸的缺失。与Atue51908株相比,NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2和L基因的同源性为92.1-98.5%。对G蛋白的编码基因序列进行同源性和遗传进化分析显示,LJX31与美国毒株V41的同源性最高、亲缘关系最近,同源性达95.1%,表明LJX31可能来源于美国。为构建BRSV LJX31的反向遗传操作系统,分别构建了基因组全长cDNA质粒,以及N、P、L和M2-1蛋白的真核表达质粒;同时,为了增加拯救病毒对细胞的适应性,本研究构建了BRSV受体蛋白CX3CR1的真核表达质粒。N、P、L、M2-1和CX3CR1这5个蛋白表达质粒作为辅助质粒,与全长基因组cDNA质粒共转染BRSV易感细胞,可进行病毒的拯救。本研究同时构建了基于T7启动子和CMV启动子的全长基因组cDNA质粒PVK-LJX31和PCI-LJX31;N、P和M2-1蛋白的编码基因直接克隆至PCI-neo载体,分别构建表达质粒PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1;L蛋白的编码基因经过密码子优化后克隆至p3xflag-CMV载体,构建表达质粒p3xflag-YH-L;CX3CR1蛋白的编码基因采用PCR方法从牛的肺组织中扩增获得,直接克隆至PCI载体,构建表达质粒PCI-CX3CR1。PVK-LJX31、PCI-LJX31、PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1、p3xflag-YH-L和PCI-CX3CR1,经酶切和序列分析确定序列正确,这样BRSV LJX31反向遗传系统所需的遗传元件均获得了相应的重组质粒。采用IFA对PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1、p3xflag-YH-L进行表达验证,结果显示每个质粒转染细胞后,其细胞内表达产物均能与相应的抗体发生反应,表明质粒均能在转染细胞中获得表达。此外,通过微基因组质粒pok(-T7)-W对LJX31基因组的顺式作用元件和调控区以及PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1和p3xflag-YH-L四个辅助质粒的功能进行验证,结果显示,pok(-T7)-W质粒转染细胞后,再用BRSV感染细胞,可在细胞中表达绿色荧光蛋白,表明LJX31基因组的顺式作用元件和调控区是有功能的;而pok(-T7)-W质粒和PCI-N、PCI-P、PCI-M2-1和PCI-YH-L四个辅助质粒共转染细胞时,却不能够在细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达,表明PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1和p3xflag-YH-L四个辅助质粒形成RNP复合物的能力、或者RNP复合物的功能有缺陷。综上所述,本研究对BRSV LJX31的全长基因组序列进行测定及分析,并构建了该毒株反向遗传操作系统的遗传元件,包括基因组质粒、辅助质粒及其功能鉴定的方法,为BRSV反向遗传平台的建立打下了坚实的基础。