目的阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(Obstructive sleep apnea hyponea syndrome, OSAHS)是以睡眠期间上气道发生反复阻塞为特征的呼吸紊乱现象。由于睡眠期间通气不足,血氧浓度降低,患者易出现嗜睡、头昏、焦虑、抑郁,进而出现高血压、脑血栓等心脑血管疾病,最终可导致患者死亡。OSAHS的发病机理主要可以归结为上气道解剖性狭窄与上气道扩张肌功能异常两个方面。流行病学调查研究显示,OSAHS男性的发病率明显高于女性,男、女之间的比例约为2-3:1。然而,临床研究表明,女性绝经后OSAHS发病率显著上升,但在使用雌激素替代治疗后其发病率降低,同时,颏舌肌的肌电活性也明显增强。这些研究结果提示雌激素对OSAHS的发病起到了重要的保护作用,但具体机制尚不明确。因此,本课题拟在以往研究的基础上,通过建立不同雌激素水平的动物模型和颏舌肌原代培养细胞模型,从体内和体外两方面研究雌激素对颏舌肌生物学功能的影响并探讨可能的分子机制。从而为OSAHS的临床预防和治疗提供理论依据。方法(1)采用卵巢切除与雌激素替代法建立不同雌激素水平的动物模型,通过颏舌肌电生理检测观察雌激素对颏舌肌功能的影响,并采用免疫组织化学方法检测大鼠颏舌肌雌激素受体的表达。(2)通过机械分离加酶消化法进行大鼠颏舌肌原代培养,采用差速贴壁法纯化细胞,并使用免疫荧光方法对培养细胞进行鉴定。(3)采用细胞免疫荧光方法鉴定雌激素受体α(ER-α)与β(ER-β)在颏舌肌成肌细胞上的表达与分布。(4)使用激光共聚焦显微镜动态观测雌激素对颏舌肌成肌细胞Ca2+转运的影响。(5)通过实时定量RT-PCR检测雌激素对颏舌肌成肌细胞肌球蛋白重链各亚型mRNA表达的影响。结果(1)雌激素对大鼠颏舌肌功能存在显著影响,随血清雌激素水平的升高,颏舌肌肌电活性增强。(2)免疫组化染色结果显示ER-α与ER-β在大鼠颏舌肌组织中呈弱阳性表达,二者的表达强度在各实验组间无明显差异。(3)细胞免疫荧光染色结果显示,α-横纹肌肌动蛋白、骨骼肌特异性肌球蛋白染色均为阳性,且阳染细胞数大于95%,说明原代培养的大鼠颏舌肌成肌细胞纯度高,可用于后续实验研究。(4)细胞免疫荧光结果显示,ER-α、ER-β在大鼠颏舌肌成肌细胞胞核与胞浆中均有表达。ER-α在胞核与胞浆中的表达均较强,ER-β主要表达在胞浆中,在胞核中的表达较弱。(5)激光共聚焦显微镜动态观测结果显示,正常条件下雌激素对颏舌肌成肌细胞胞浆内Ca2+浓度没有明显影响。但在酸性条件下雌激素能够降低颏舌肌成肌细胞胞浆Ca2+浓度,减少钙离子在细胞内的蓄积。(6)荧光定量RT-PCR结果显示,雌激素能够明显上调MHC I mRNA的表达,下调MHC IIb mRNA的表达。对MHC IIa和IIx mRNA的表达无明显作用。结论(1)采用双侧卵巢切除与雌激素替代法建立了不同雌激素水平的大鼠动物模型,颏舌肌电生理检测证实雌激素可以影响大鼠颏舌肌的功能。(2)成功培养了大鼠颏舌肌成肌细胞,并且细胞纯度高,可作为体外相关生物学研究的细胞模型。(3)颏舌肌中存在雌激素受体α、β的阳性表达,并进一步在细胞水平明确两种雌激素受体在胞浆与胞核中的分布与定位。(4)在酸性环境下,雌激素可能通过调控颏舌肌成肌细胞胞浆内钙离子浓度影响颏舌肌的功能。(5)雌激素可能通过调节颏舌肌成肌细胞肌球蛋白重链各亚型mRNA的表达来影响颏舌肌的功能。