植酸及其盐类广泛存在于自然界的各种植物组织和粮食产品中,是磷和肌醇的主要存储形式,同时对保持机体磷的平衡起重要作用。植酸酶作为一种单胃动物的饲料添加剂,可以提高植物饲料中磷的利用率,减少磷排泄对环境的污染,同时还能降低植酸的抗营养作用。植酸酶在动物、植物和微生物中均有发现。微生物植酸酶由于种类丰富、表达量相对较大、容易提取而成为商品植酸酶的重要来源。虽然国内外已经有数种植酸酶商品问世,但还没有一种非常完美的产品。利用诱变和基因工程手段改善植酸酶性质、提高植酸酶生产能力是当今植酸酶研究的主要方向。本实验室从土壤中筛选到一株植酸酶活力较高的霉菌—黑曲霉A3214,对黑曲霉A3214进行紫外线诱变和亚硝基孤诱变后获得植酸酶活力提高22%的诱变株N14,利用N14的植酸酶基因构建植酸酶基因工程醉母,获得高植酸酶活力的植酸酶基因工程酵母E22。本研究对酵母工程菌E22所产的植酸酶进行分离纯化,得到电泳纯的酶液。使用不同的化学修饰剂对纯酶液进行化学修饰研究不同基团对酶的影响特别是对酶液pH适性的影响。主要研究与结果如下。1.植酸酶的分离纯化利用BMGY、BMMY两种毕赤酵母培养基对E22酵母工程菌进行液体发酵培养,过滤离心后获得相应植酸酶粗酶液。粗酶液通过66%的丙酮沉淀分离、透析过夜,最后上sepharose fast flow离子交换层析柱,用500mL0.01MpH5.0醋酸缓冲液洗杂,再用400mL 1mol/L氯化钠加上400mL蒸馏水梯度淋洗,分部收集酶液,获得电泳纯的E22植酸酶液。2.植酸酶的化学修饰用不同浓度的IAc、巯基乙醇、TNBS、NBS、PMSF、Phenylglyoxal等六种化学修饰剂与植酸酶纯酶液作用,然后在正常条件下测定植酸酶的活性,以不用修饰剂时的植酸酶活性为100%,分析修饰剂对植酸酶活性的影响。实验表明:完全修饰后,IAc、疏基乙醇、Phenylglyoxal修饰的植酸酶酶活完全消失,而TNBS、NBS、PMSF所修饰的植酸酶随着修饰剂浓度的增大,酶活性逐渐降低,当修饰剂浓度分别达到5mmol/L、11mmol/L、6mmol/L时活力则保持稳定不再下降。3.化学修饰对植酸酶pH适性的影响用5mmol/L TNBS、13mmol/L NBS、9mmol/L PMSF分别修饰植酸酶酶液,在不同的pH条件下测定其活性变化情况,与未修饰酶作出分析比较,研究修饰基团对植酸酶pH适性的影响。实验结果表明:用TNBS修饰植酸酶的赖氨酸残基,酶活分别在pH2.5和pH5都有一个最适点,与未被修饰的植酸酶比较,修饰后的植酸酶的最适pH发生了小小的平移,并且相对于原始植酸酶pH的适性扩展到了pH9,在pH8.0时候修饰酶的活力仍有90u/ml左右;NBS修饰酶的色氨酸残基后,其活性在pH2.5处的一个最适点基本消失,而在pH5.5和pH6.0则有一个酶活最高峰;PMSF修饰酶的丝氨酸残基后,第一个酶活高峰出现在pH3,第二个高峰与未被修饰的植酸酶一样出现在pH5.5,考虑到实验误差问题,丝氨酸基团对pH适性影响应该不大。