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围产期是反刍母畜生产周期中最为关键的时期。该时期最大特点是能量负平衡,此阶段母畜的干物质采食量和血浆中的非脂化性脂肪酸(NEFA)水平会发生巨大的变化。烟酸可以通过NEFA和p53-SIRT6-Foxo1轴对肝脏糖异生过程进行调控,从而促进肝脏糖异生缓解能量负平衡。本研究以体外培养羊肝细胞为基础,探讨NEFA和烟酸对羊肝细胞增殖、糖异生限速酶以及p53-SIRT6-Foxo1轴相关基因的mRNA和蛋白的相关影响。本试验主要分为以下四个部分:试验一 利用两步灌流法对绵羊肝细胞进行体外培养。随后对培养的细胞进行形态和功能鉴定,细胞形态鉴定用糖原染色法检测,功能鉴定用细胞免疫荧光化学染色法检测。形态鉴定结果,显微镜下染色的细胞多为圆形或为卵圆形,形态大小不一。贴壁生长均匀分布,细胞胞体充盈饱满,细胞核分为单核或多核。观察到的细胞特征,符合肝细胞的形态特征。羊肝细胞的功能检测结果,肝细胞中CK18表达呈阳性,即测定细胞具有肝细胞的功能特点,测定细胞为肝细胞。此外对细胞周期和细胞存活率进行了检测,细胞周期符合肝细胞正常的生长周期,细胞存活率较高,可满足试验需求。试验二 肝细胞中添加NEFA,对羊肝细胞的增殖、糖异生限速酶以及p53-SIRT6-Foxo1轴相关基因mRNA表达量进行测定,并对NEFA添加浓度的进行筛选。NEFA 添加浓度为 0 mmo1/L、0.3 mmo1/L、0.6 mmo1/L、1.2 mmo1/L、2.4 mmo1/L、4.8 mmo1/L。结果表明,添加NEFA可以显著抑制羊肝细胞的增殖,在1.2mmo1/l浓度组对细胞增殖的抑制作用最强。随着NEFA浓度的增加,羊肝细胞磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、丙酮酸羧化酶(PC)活性逐渐降低,NEFA抑制PEPCK、PC酶活性。添加不同浓度NEFA,显著降低基因G6P、Foxo1、SIRT6、PEPCK、P53、PC基因的mRNA表达量,增加AKT、PI3K基因的mRNA表达量,GLU2、INSR基因的mRNA表达量变化不显著。试验三 肝细胞中添加烟酸,探究烟酸对肝细胞的作用,烟酸添加浓度为(0mol/L、10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L),研究不同浓度的烟酸对羊肝细胞的增殖、糖异生限速酶以及p53-SIRT6-Foxo1轴相关基因mRNA表达量的影响。试验结果表明,添加烟酸可以促进羊肝细胞的增殖,可以显著提高肝细胞糖异生关键酶PEPCK、PC活性,10-4mol/L浓度的烟酸对PEPCK、PC活性促进作用效果最强。烟酸可提高G6P、Foxo1、SIRT6、GLU2、PEPCK、P53、PC基因的mRNA表达量,降低AKT、PI3K、INSR基因的mRNA表达量。试验四 肝细胞中添加NEFA和烟酸,探究NEFA和烟酸对肝细胞增殖、糖异生限速酶及p53-SIRT6-Foxo1轴相关基因mRNA和蛋白表达量的影响。试验结果表明,烟酸可以缓解NEFA对肝细胞增殖的抑制作用。与NEFA组比较,烟酸+NEFA组显著升高了 PEPCK、PC、G6P、Foxo1、P53、AKT、SIRT6、INSR、GLU2 基因的 mRNA表达量。与NEFA组比较,烟酸+NEFA组显著升高了PEPCK、PC、G6P、Foxo1、P53、SIRT6、GLU2基因的蛋白表达量。