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B细胞白血病和淋巴瘤是恶性血液病中最常见的亚型,复发/难治是临床上导致治疗失败的主要原因,近1/3患者因此不治而亡。近五年来,可特异性识别B细胞表面CD19、CD19的嵌合抗原受体的T细胞(CART)在针对复发/难治B细胞淋巴瘤的临床试验中取得了非常显著的疗效,引发了全球范围内CART细胞的开发和利用狂潮。CAR结构主要由T细胞受体的胞外抗原结合区、跨膜区及胞内信号区三部分组成。目前国内外大部分CD19-CART的临床前和临床试验采用的是含有CD28或者4-1BB共刺激分子的二代CART技术。迄今为止全球范围内针对B细胞淋巴瘤/白血病的公开注册的临床试验近80余个。然而,我国国内所进行的抗CD19-CART细胞临床治疗的效果较国际水平有较大差距。主要原因在于CAR基因结构构造不够理想,体外基因修饰技术不稳定,临床前CD19-CART免疫治疗有效性和安全性研究数据不充分,因此规范CD19-CART临床前细胞制备工艺,完善质量控制体系,制备有效性和安全性的CD19-CART细胞产品对于规范CART细胞治疗显得尤为重要。由于CARs提供MHC非依赖性抗原识别,可以避免肿瘤细胞用于免疫逃逸的一些机制,例如MHC分子的下调等,其优点主要是高效、靶向结合肿瘤相关抗原,激活特异性杀伤。Tomonori Tsukahara等的研究表明CART是否能在肿瘤部位快速归巢并维持较高的浓度关系着CART免疫治疗的成败。CART细胞自身的数量和体内分布情况决定着其在体内能否与肿瘤抗原结合并将其清除。因此观察和探索CART细胞在免疫治疗过程的分布,归巢和扩增情况,有助于完善CART细胞肿瘤免疫治疗。目前全球范围内关于抗CD19-CART细胞免疫治疗的Ⅰ期临床试验在治疗复发或难治的B细胞急性白血病、慢性白血病、淋巴瘤取得了显著的疗效。但是仍有部分患者在应用抗CD19-CART细胞免疫治疗后未取得缓解或者缓解后再复发。因此优化CART的治疗在临床上显得尤为重要。目前国内外大部分关于CD19-CART的临床试验均未对T细胞进行分选。因此临床试验中每位患者输注的CD19-CART的亚型组成均不相同。这种亚型组成差异将导致不同患者之间CD19-CART治疗效果的差异,从面临床上每位患者接受的CD19-CART免疫治疗难以实现标准化。Fred Hutchinson肿瘤研究中心Daniel Sommermeyer等的研究首次将CD19-CART进行分选,研究了 T细胞不同亚型之间的功能差异,证实了 CD4+和CD8+T细胞在CD19-CART抗肿瘤发挥着不同但相互依存的作用。CD8+T细胞主要负责杀伤和清除肿瘤细胞的作用,起到主要的抗肿瘤免疫作用,CD4+T细胞主要负责分泌细胞因子,促进CD8+T增殖,起到辅助CD8+T细胞对肿瘤的杀伤的作用,CD8+T细胞和CD4+T细胞在CD19-CART免疫治疗过程中起到互相促进,相互依赖的作用,二者缺一不可,但其研究中并未明确CD4+和CD8+T细胞的最佳比例和有效剂量。同时该研究中进一步将CD4和CD8分为原始T细胞(TN)、效应T细胞(TE)、中心记忆T细胞(TCM)、效应记忆T细胞(TEM),探索其在CART免疫治疗过程中发挥的不同作用,这种方法在CART临床培养和临床应用中基本无法实现。因此探索CD4+和CD8+T细胞的最佳比例和临床有效剂量显得十分必要。研究目的:构建CD19-CART体外扩增体系,评估其安全性和有效性。观察CD19-CART细胞回输后体内的分布、归巢、扩增情况。同时探索CD4+和CD8+T细胞在CD19-CART免疫治疗过程中扮演的角色和最佳组合比例以及CD4+和CD8+T细胞的有效剂量。从而优化CD19-CART免疫治疗,实现CD19-CART细胞免疫临床治疗的标准化和国际化。研究方法:第一部分:我们构建了 CD19-CART四质粒慢病毒表达载体,确立CD19-CART体外培养扩增体系,通过体外细胞杀伤实验和体内动物试验评估CD19-CART细胞免疫治疗的有效性和安全性。第二部分:我们采用荧光标记构建CD19-Fluc-CART示踪细胞,通过体内动物实验观察CD19-CART回输体内后的分布、归巢、扩增情况。第三部分:采用免疫磁珠阳性分选的方法将外周血单核细胞(PBMC)分选为CD4+和CD8+T细胞,然后采用慢病毒转染方法分别构建CD4+CD19-CART细胞和CD8+CD19-CART 细胞,然后将其按照不同 CD4/8 比例(CD4,CD4/8:3:1,1:1,1:3,CD8)进行组合,通过体外和体内细胞杀伤实验观察CD4+和CD8+T细胞扮演的角色和最佳比例。第四部分:基于第三部分实验,我们发现CD8+CD19-CART细胞主要负责早期杀伤和清除肿瘤肿瘤细胞的作用,其早期完全清除肿瘤对于CD19-CART免疫治疗十分关键,因此我们选择了三种不同剂量的CD8+CD19-CART分别为:低剂量组(2×106)、中剂量组(5×106)、高剂量组(1X107),通过体内杀伤实验观察能够完全清除肿瘤细胞的最低CD8+CD19-CART有效剂量。CD4+CD19-CART主要负责分泌细胞因子,促进激活肿瘤免疫杀伤,对于维持CART免疫治疗后期维持CD8+CD19-CART有效杀伤和预防肿瘤复发起到重要作用,因此确定CD8+CD19-CART有效剂量后,我们固定CD8+CD19-CART剂量,通过体内动物实验观察不同剂量CD4+CD19-CART和CD8+CD19-CART混合后的杀伤情况,从而确定CD4+CD19-CART的有效剂量。研究结果:1.成功构建了 CD19-CART体外扩增培养体系,体外细胞实验和体内动物杀伤实验结果表明构建的CD19-CART能够有效的杀伤CD19肿瘤抗原表达阳性的细胞。且CD19-CART高剂量组体内杀伤效果好于CD19-CART低剂量组。2.在小鼠CD19抗原阳性淋巴瘤模型内,CD19-CART回输体内后能够快速的归巢,与肿瘤抗原结合,并能在小鼠体内长期的存活。形成免疫监视和免疫记忆。3.不同CD4/8比例体外杀伤实验结果表明:CD8+CD19-CART主要负责直接杀伤肿瘤细胞,CD4+CD19-CART细胞主要负责分泌细胞因子(人源IL-2,IL-10,IFN-γand TNF-α)。体内动物实验结果表明CD4/8 1:1,1:3组两组小鼠的生存期最长。CD8+CD19-CART早期完全清除肿瘤十分重要。CD8+CD19-CART剂量不足,早期不能完全清除肿瘤细胞,肿瘤很快复发。CD4+CD19-CART负责辅助CD8+CD19-CART杀伤肿瘤细胞,如果缺乏CD4+CD19-CART,即使早期完全清除肿瘤细胞,肿瘤也终将复发。4.CD8+CD19-CART不同剂量组体内细胞杀伤实验结果表明:中剂量组(5 × 106)和高剂量组(1× 107)早期完全清除肿瘤细胞,而低剂量组(2×106)早期未能完全清除肿瘤细胞,肿瘤很快复发。因此CD8+CD19-CART有效剂量确定为:中剂量组(5×106)。固定CD8+CD19-CART有效剂量后,我们发现CD4+CD19-CART剂量至少为CD8+CD19-CART有效剂量的1/3,才能保证CART免疫治疗的远期杀伤效果,NPG淋巴瘤小鼠能长期无复发生存。研究结论:1、采用4-1BB共刺激分子的二代CAR设计,四质粒慢病毒转染构建CD19-CART体外培养体系能够保证CD19-CART免疫治疗的安全性和有效性,与目前国际最新CD 19-CART临床试验和临床前试验保持一致。2、CART的靶向归巢能力和体内存活时间和数量对于CD19-CART体内杀伤效果和免疫治疗效果至关重要。3、CART分选可以优化临床CD19-CART免疫治疗,按照CD4 CD19-CART和CD8 CD19-CART有效剂量进行输注可以最大限度保证CD19-CART临床治疗效果。避免不同患者之间因T细胞子集比例不同造成的治疗效果的差异。使不同中心间的临床试验的结果方便比较,综合,进行大数据分析。4、CART标准化治疗是未来CART领域的发展方向,因此CART分选的研究显得十分重要,但仍需大规模临床试验结果的进一步验证。