circASS1调控亲本基因ASS1并吸附miR-4443降低乳腺癌细胞株MDA-MB-231侵袭转移能力

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目的:  乳腺癌的侵袭转移是临床上晚期乳腺癌治疗过程中的一大难题,但是关于乳腺癌转移的潜在分子机制仍然没有明确。本研究的目的是探讨环状RNA circASS1(hsa_circ_0089105)在乳腺癌中的作用,这也许会成为一个新的乳腺癌靶向治疗靶点,也是一个潜在的生物学诊断标志物。  方法:  1、使用环状RNA的基因芯片分析乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231中的环状RNA。  2、进一步使用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)验证环状RNA在乳腺癌细胞株:MCF-7,MDA-MB-231中的表达水平差异。使用原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)判断环状RNA在细胞中的定位并通过sanger测序判断circASS1的接头序列。  3、构建circASS1过表达质粒,通过转染使乳腺癌细胞株MCF-7,MDA-MB-231过表达circASS1,采用RT-qPCR检测过表达倍数,质粒转染24小时后进行功能学实验,探索过表达circASS1对MCF-7及MDA-MB-231细胞生物学特性的影响。同时,使用RT-qPCR及Western blotting探索circASS1对其亲本基因精氨琥珀酸合酶1(argininosuccinate synthase1,ASS1)表达水平的影响。  4、采用生物信息学软件预测circASS1的下游潜在miRNA。使用双荧光素酶报告基因检测circASS1与miR-4443是否存在吸附关系。对MCF-7细胞进行miR-4443模拟物(mimics)的转染,划痕实验及transwell迁移侵袭实验证实miR-4443功能。最后通过过表达circASS1验证是否能抑制miR-4443的生物学功能。  结果:  1、环状RNA基因芯片在MCF-7和MDA-MB-231细胞株中分别检测到上万条环状RNA。以MCF-7的环状RNA表达水平为基准,MDA-MB-231存在916条表达水平上调的环状RNA和221条表达水平下调的环状RNA。关注到环状RNA has_circ_0089105下调约0.067倍,且其亲本基因为精氨琥珀酸合酶1(argininosuccinate synthase1,ASS1),故我们命名其为circASS1。  2、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)结果证实,与MCF-7细胞株相比,circASS1在MDA-MB-231细胞株中下调至0.07倍,circBase database显示circASS1是由染色体9q34.11区精氨琥珀酸合酶1的外显子9,10和11环化形成的,Sanger测序结果显示了circASS1的接头序列。原位杂交技术证实circASS1在细胞核和细胞质均存在。  3、转染circASS1过表达质粒(p-circASS1)的MDA-MB-231细胞株中的circASS1的表达水平提高了约600倍,且划痕实验及transwell迁移和侵袭实验表明,与对照组相比,过表达circASS1的MDA-MB-231细胞株的侵袭及迁移能力显著减弱,另一方面,转染circASS1的抑制物(si-circASS1)的MCF-7细胞株中的circASS1的表达水平下降至0.188倍;同时,划痕实验及transwell迁移和侵袭实验表明,实验组的侵袭及转移能力明显加强,提示circASS1能抑制乳腺癌细胞的侵袭及转移能力。circASS1能影响其亲本基因精氨琥珀酸合酶1(argininosuccinate synthase1,ASS1)表达水平,两者呈正相关。Western blotting也表明,与对照组相比,过表达circASS1的MDA-MB-231细胞株中,ASS1的蛋白表达量提高。  4、MiRanda生物信息学预测表明miR-4443包含一个与circASS1匹配的结合位点并且有很强的结合能力及很高的可能性。双荧光素酶报告系统结果提示circASS1能过通过结合位点吸附miR-4443。同时,划痕实验及transwell迁移实验均表明miR-4443能促进MCF-7细胞株的侵袭迁移能力。由circASS1和miR-4443的相反的生物学功能,提示circASS1具有miRNA“海绵”的作用。  结论:  1、circASS1表达水平与乳腺癌细胞侵袭转移能力呈负相关。  2、生物信息学显示circASS1可吸附miR-4443,其表达可负向调控miR-4443的生物学功能。  3、circASS1可正向调控其亲本基因ASS1的表达水平。  4、过表达circASS1很有可能改善乳腺癌病人的预后。
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