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牙髓炎是人类口腔的常见病、多发病之一。目前的治疗方法尚未能完全替代牙体组织的功能。组织工程的临床应用为恢复牙齿活性和功能带来新的希望。特别是成功分离培养出具有自我更新和多向分化能力的牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs），因其可以形成牙髓牙本质复合体，故是牙齿组织工程重要的种子细胞。在构建组织工程牙齿过程中，除种子细胞和支架材料外，细胞所处的微环境、细胞间相互作用以及细胞内外信号分子的调控因素等都是影响细胞生长分化进而影响组织工程实现的重要因素。在牙髓炎性环境下，炎症因子和致炎细菌成分均可影响DPSCs的生物学功能。Toll样受体4（Toll-like Receptor4，TLR4）作为细菌壁成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的特异性受体，在启动DPSCs的天然免疫及炎症反应中发挥重要作用，并且在牙髓炎发生时，牙髓中革兰阴性菌释放的各类毒性产物包括LPS的含量明显增加。但目前关于LPS及其受体TLR4影响DPSCs分化作用及机制的研究甚少。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路可以整合生长因子、能量状态等相关信号通路，调控细胞自噬、生长、免疫、炎症、凋亡、蛋白合成与能量代谢等，是近年来各学科研究的热点领域。目前关于mTOR在干细胞分化过程中发挥重要作用的研究已成为学者们关注的重点，但是mTOR在细菌毒性炎性刺激的干细胞如LPS刺激的DPSCs中的生物学机制尚不明确。我们已知牙髓组织炎症是牙髓病中最主要的疾病，细菌是其重要的致病因素，因此阐明细菌成分脂多糖在DPSCs分化中的调控作用及其细胞内分子机制具有重要的意义。本课题在体外分离、培养和鉴定人DPSCs的基础上，通过LPS和mTOR的特异性抑制剂雷帕霉素作用于DPSCs研究LPS活化的TLR4信号途径调控的人DPSCs分化作用及mTOR对其的影响，以期阐明mTOR信号通路在LPS调控DPSCs分化中的分子机制，对阐明牙髓损伤修复时DPSCs分化的分子机制有重要意义，为DPSCs组织工程应用和将来临床活髓保存治疗提供新方法和新思路。所取得的主要研究结果如下：1、脂多糖受体TLR4和mTOR在人DPSCs分化中的表达及变化为获得纯化的人DPSCs，我们使用改良酶消化法分离获得原代人牙髓细胞，利用有限稀释法克隆培养并通过传代纯化细胞，结果显示所培养的DPSCs形态典型、均一。采用流式细胞仪定量分析牙髓干细胞的Stro-1等表型的阳性表达率，表明所获细胞具有间充质干细胞属性；将克隆鉴定的DPSCs分别进行矿化诱导及成脂诱导14天，结果显示茜素红染色阳性的矿化结节形成及油红O染色阳性的脂滴形成，表明DPSCs矿化诱导或成脂诱导后向成牙本质样细胞或成脂样细胞分化。以上结果表明：本研究克隆鉴定的DPSCs具有自我更新及多向分化的潜能，具有间充质干细胞的特性。从而再次表明DPSCs在牙齿组织工程领域有着广阔的前景，也为本课题进一步以DPSCs进行的研究奠定了基础。为探索DPSCs分化过程中脂多糖受体TLR4和mTOR的表达情况，我们体外普通培养液培养上述克隆鉴定的DPSCs24h，提取RNA，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）结果显示，DPSCs内存在TLR4基因和mTOR基因的表达；另外我们矿化诱导DPSCs7天、10天和14天，通过实时定量PCR （Real-time PCR）检测DPSCs内TLR4和mTOR的表达变化，结果表明在两周内随时间延长TLR4和mTOR的表达不断增强，提示TLR4和mTOR信号途径可能参与DPSCs的分化过程。2、脂多糖对DPSCs分化过程中TLR4和mTOR表达的影响为进一步明确TLR4和mTOR是否参与脂多糖调控的DPSCs分化过程，我们将DPSCs在不同的诱导条件下培养7天、10天和14天。分组情况如下：对照组加矿化诱导液，LPS刺激组为含终末浓度为1μg/mL LPS的矿化诱导液。Real-time PCR结果显示LPS刺激组的TLR4mRNA和mTOR mRNA表达明显高于对照，并且随时间延长LPS刺激组的TLR4和mTOR表达均增高，以上结果提示TLR4和mTOR信号均可能参与脂多糖调控的DPSCs分化过程。3、mTOR在脂多糖调控的DPSCs分化中的作用为更好的理解脂多糖LPS对DPSCs调控的作用及mTOR在其中的作用机制，我们通过含各种刺激的矿化液分别诱导DPSCs7天、10天、14天，对照组加矿化诱导液，实验组LPS组加含终末浓度为1μg/mL LPS的矿化诱导液，实验组Rapa+LPS组加含1μM Rapa和1μg/mL LPS的矿化诱导液。通过ALP染色和茜素红染色结果显示，LPS组的ALP活性和矿化结节明显高于对照，而Rapa+LPS组则明显弱于LPS组。Real-time PCR结果显示Rapa+LPS组的DSPP、BSP、OCN基因的表达明显低于LPS组。而LPS组的DSPP表达明显高于对照组；在10d、14d时LPS组的BSP基因表达也明显高于对照；但是OCN基因的表达在7d时LPS组明显高于对照组，在14d时LPS组的OCN表达低于对照组。同时我们通过含各种刺激的矿化液分别诱导DPSCs21天，扫描电镜结果和茜素红定量法结果显示，LPS组能够形成细胞外矿化基质小球并且钙含量明显高于对照，但Rapa+LPS组显示雷帕霉素抑制LPS诱导的矿化基质小球形成和钙含量。以上结果表明在一定时间内，一定浓度的LPS可以诱导DPSCs的分化能力，雷帕霉素则抑制LPS调控的分化作用，从而间接证实mTOR可能参与LPS调控的DPSCs分化作用。综上所述，本研究认为LPS活化的TLR4信号途径可以诱导DPSCs的分化能力，mTOR可能在LPS诱导的DPSCs分化中发挥重要作用，这对阐明牙髓损伤修复时DPSCs分化的分子机制有重要意义，为DPSCs组织工程应用提供新的思路，也为将来临床活髓保存治疗提供新的方法。