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目的本研究对两个系列1,2,4-三嗪衍生物进行体外抗肿瘤活性筛选,考察其对胃癌细胞增殖、凋亡的影响并探讨其作用机制,为合成毒性更低、抗肿瘤效果更好的1,2,4-三嗪衍生物提供基础。方法1.抗肿瘤活性筛选利用MTT比色法分别对所合成的两个系列1,2,4-三嗪衍生物进行体外抗肿瘤活性筛选,评价两个系列化合物的体外抗肿瘤效果。2.抗肿瘤机制研究（1）利用克隆形成、生长曲线实验、时间依赖实验和流式细胞术等实验方法分别检测化合物对肿瘤细胞增殖作用的影响;（2）采用流式细胞术检测化合物对肿瘤细胞凋亡率和线粒体膜电位的影响,探讨化合物对肿瘤细胞凋亡作用的影响;（3）Western blot技术和si RNA干扰技术检测化合物作用于肿瘤细胞后,凋亡通路相关蛋白以及其他信号通路相关蛋白的表达变化,探讨化合物抗肿瘤的分子机制。结果1.在1,2,4-三嗪衍生物系列Ⅰ中,MTT检测结果表明化合物V-11对胃癌细胞MGC-803的活性抑制作用优于其他四种肿瘤细胞,其IC50为8.22μmol/L;克隆形成、生长曲线及流式细胞术实验表明化合物V-11抑制MGC-803细胞增殖作用且将细胞阻滞在G2/M期。Western Blot实验显示化合物V-11抑制NEDDylation过程中E1、E2、E3酶与NEDD8蛋白的表达,同时NEDDylation底物蛋白p21蛋白以及ATF4蛋白的降解均被抑制,下游蛋白CHOP、DR5和Noxa蛋白表达增多。同时流式细胞术检测细胞凋亡率随化合物V-11作用浓度增加而增加,Western blot实验检测到随着化合物V-11作用浓度升高,内源性凋亡途径相关蛋白Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白和XIAP蛋白表达下调,Caspase3和Caspase9蛋白被剪切,同时凋亡底物蛋白PARP也被剪切。2.基于1,2,4-三嗪衍生物系列Ⅰ化合物具有良好的抗肿瘤活性,优化合成得到1,2,4-三嗪衍生物系列Ⅱ。MTT检测结果表明化合物Ⅱ-13对胃癌细胞MGC-803的活性抑制作用优于其他四种肿瘤细胞,其ⅠC50为0.35μmol/L。克隆形成、生长曲线及流式细胞术实验均表明化合物Ⅱ-13抑制胃癌细胞MGC-803细胞和SGC-7901细胞的增殖并将细胞阻滞在G2/M期。Western blot实验结果表明化合物Ⅱ-13无抑制MGC-803细胞NEDDylation过程的作用。流式细胞术检测结果表明随着化合物Ⅱ-13作用于胃癌细胞的浓度增加,活性氧ROS水平升高,线粒体膜电位下降和细胞凋亡率升高。经抗氧化剂NAC处理后,化合物Ⅱ-13所诱导的这些结果均能够被NAC逆转。Western Blot实验结果表明随着化合物Ⅱ-13作用浓度增加,ERK1/2信号通路中p-c-raf、p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-P90RSK和c-Myc蛋白均随浓度增加而表达下降;内源凋亡途径蛋白Caspase3/9和PARP均被剪切;外源凋亡途径中DR5蛋白表达上调和Caspase8被剪切。同样,在经抗氧化剂NAC处理后,化合物Ⅱ-13所引起的这些蛋白的变化均能够被NAC逆转。利用si RNA技术和Western Blot进行实验检测,结果表明化合物Ⅱ-13作用于胃癌细胞后,p-ERK1/2表达量下降,进而上调DR5蛋白的表达,促进了凋亡的发生。结论1.化合物V-11和Ⅱ-13为两个系列的1,2,4-三嗪衍生物,两者结构不同,抗肿瘤活性不同。其中引入查尔酮活性片段的1,2,4-三嗪衍生物系列Ⅱ化合物,体外抗肿瘤活性得到明显的提高。其中化合物Ⅱ-13的抗肿瘤活性明显优于V-11。2.化合物V-11和Ⅱ-13的抗肿瘤作用机制不同,分别为:化合物V-11通过抑制胃癌细胞MGC-803的NEDDylation过程,使底物蛋白p21和ATF4蛋白的降解受到抑制,从而诱导了MGC-803细胞内源性凋亡的发生;而化合物Ⅱ-13化合物没有明显抑制胃癌细胞的NEDDylation过程,而是通过ROS的产生,抑制了MAPK通路中的p-ERK1/2途径,下调的p-ERK1/2进而上调了外源途径中的DR5蛋白,联合内源性凋亡途径,诱导了胃癌细胞MGC-803和SGC-7901的凋亡。