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目的:通过构建小鼠穿透性角膜移植模型探讨角膜植片细胞衰老对角膜移植免疫排斥反应的影响及机制。方法:1、小鼠角膜移植免疫排斥期间的细胞衰老表型分析。分别以BALB/C或C57BL/6小鼠为角膜供体,BALB/C小鼠为角膜受体构建穿透性角膜移植模型,分为正常组、同系角膜移植组和异系角膜移植组,于移植免疫排斥反应阶段收集角膜样本。通过衰老相关的β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-Gal)染色明确角膜植片的细胞衰老表型,并借助角膜植片冰冻切片分析衰老细胞在角膜中的分布;使用Western Blot分析角膜植片中衰老相关蛋白p16、p21的表达水平。2、供体角膜衰老相关基因p16缺失对小鼠角膜移植免疫排斥反应的影响。分别将野生型和p16缺失型的C57BL/6小鼠作为角膜供体构建异系角膜移植模型,评价角膜供体细胞衰老对角膜移植免疫排斥反应的影响:通过裂隙灯观察角膜移植免疫排斥反应并记录角膜植片存活时间;通过免疫荧光实验评估不同组别角膜植片中炎性细胞的浸润情况。3、抗衰老药物ABT-263清除衰老细胞对小鼠角膜移植免疫排斥反应的影响。建立异系角膜移植组和异系移植并抗衰老药物Navitoclax(ABT-263)干预组,评估药物清除衰老细胞对角膜移植免疫排斥的影响:使用裂隙灯观察抗衰老药物对角膜移植免疫排斥的影响并记录植片存活时间;利用Real-Time PCR检测角膜植片中主要炎性细胞因子(白介素(interleukin,IL)-1β、IL-12、IL-17A、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α以及干扰素(interferon,IFN)-γ)的表达情况;同时借助SA-β-Gal染色以及Real-Time PCR等实验手段评估ABT-263清除角膜植片中衰老细胞的效果。4、细胞衰老对角膜植片以及虹膜-睫状体组织中抗原提呈细胞活化的影响。构建异系小鼠角膜移植模型并结合抗衰老药物ABT-263干预,通过Real-time PCR检测不同组小鼠角膜移植早期(移植术后10天)角膜植片以及虹膜组织中抗原递呈细胞活化的相关指标的表达水平(主要包括IL-1β、TNF-a炎性细胞因子以及CD80/86等共刺激分子),初步确定细胞衰老对抗原递呈细胞活化的影响。结果:1、免疫排斥过程中,角膜植片中存在细胞衰老表型。与正常小鼠角膜相比,异系移植组和同系移植组角膜植片基质层和内皮层均存在细胞衰老,并且异系移植组的细胞衰老表型重于同系移植组;异系移植组中衰老相关蛋白p16、p21表达量明显高于同系移植组。说明角膜移植术后角膜植片出现了细胞衰老表型,并随免疫排斥反应进展而加重。2、供体角膜缺失衰老相关基因p16可延缓角膜移植免疫排斥反应。与野生型小鼠角膜供体移植相比,p16基因缺失的供体组角膜植片存活时间显著延长,CD45~+炎性细胞的浸润明显减少,提示细胞衰老可促进角膜移植免疫排斥反应的发生。3、通过药物干预清除角膜细胞衰老可有效抑制角膜移植排斥反应的发生。相比于未干预组,抗衰老药物ABT-263干预治疗后,角膜移植免疫排斥反应明显减轻,主要表现为:角膜植片更透明,存活时间显著延长;角膜植片中促炎性细胞因子的表达水平降低。此外,我们进一步通过SA-β-Gal染色以及Real-Time PCR证明ABT-263可以减轻角膜植片的衰老表型。以上结果表明清除衰老细胞可有效减轻角膜移植免疫排斥反应。4、细胞衰老可影响角膜移植免疫排斥过程中抗原递呈细胞的活化。与未干预组相比,在移植术后10天左右,抗衰老药物ABT-263的干预治疗可明显下调角膜植片以及虹膜-睫状体组织中与抗原递呈细胞活化相关的炎性细胞因子以及共刺激分子的表达,提示细胞衰老参与了角膜移植免疫排斥过程中抗原递呈细胞的活化。结论:1、角膜移植免疫排斥过程中,角膜植片内皮层和基质层均出现细胞衰老表型;抑制或清除衰老细胞可明显延缓角膜移植免疫排斥反应。2、初步明确衰老细胞可通过刺激抗原递呈细胞的活化促进角膜移植免疫排斥反应。