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水通道蛋白-4（aquaporin-4，AQP4）是脑和视网膜中最主要的一种水通道蛋白。在视网膜中，AQP4位于胶质细胞（包括星形胶质细胞及Müller细胞）的特殊膜域，使水沿着静水压和渗透压的梯度从高向低流动。国内外的研究资料表明，AQP4不仅与正常视网膜中水、电解质、渗透压平衡的维持和眼内压的调节有关，而且与疾病状态下视网膜水肿时水的异常转运有关；在高眼压/再灌注损伤大鼠模型中,不仅视网膜内AQP4的表达量可出现异常，而且其在视网膜中的定位也可发生改变。上述结果提示，高眼压/再灌注损伤可导致AQP4的定量及定位的异常，但是引起这些异常的机制仍不清楚。有资料显示，包括AQP4在内的部分膜蛋白可发生内化（internalization）－即其亚细胞定位发生改变，并同时伴随其功能的变化，而且内化入胞的蛋白质也可分选（sorting）至溶酶体，在此过程中他们被水解酶完全降解；目前，关于高眼压及再灌注损伤所致AQP4的改变是否与其内化及溶酶体内降解有关，尚未见报道。因此，本课题从在体及离体两方面展开研究，通过大鼠模型研究急性高眼压(acute ocular hypertension, AOH)及再灌注损伤条件下AQP4内化/溶酶体分选的规律，并通过离体实验研究AQP4内化/溶酶体降解的机制。本研究结果将阐明高眼压视网膜损伤的分子机制，并可为视网膜水肿防治的新药开发提供实验基础。研究目的1.研究急性高眼压/再灌注损伤模型介导大鼠视网膜AQP4内化/溶酶体分选的发生及其时空变化规律，并探讨其与视网膜水肿发生之间的关系。2.通过加压细胞培养，研究压力因素对AQP4内化/溶酶体降解的影响，对高眼压条件下视网膜AQP4内化/溶酶体分选的机制进行初步探讨。研究内容和方法1.成年健康雌性SD（Sprague–Dawley）大鼠180只，随机分为高眼压组与再灌注组用于造模。大鼠麻醉后固定于立体定位仪上，采用左眼前房灌注加压法制作110mm Hg急性高眼压大鼠模型；高眼压组根据高眼压维持时间分为高眼压5、10、30、60、90min等5组；再灌注组在维持高眼压状态60min后，根据再灌时间分为再灌注0、1、2、4、8、12h等组；每组大鼠的右眼平均分为两部分，一半作为正常对照组，另一半作为假手术组，只穿刺，不加压，以排除操作过程对实验结果的影响。造模结束后，每组选取6只大鼠，剥离视网膜后采用干-湿重法检测各组视网膜组织含水量的变化；剩余的大鼠经过灌流固定后，进行视网膜切片及铺片，使用HE染色观察各组视网膜（切片）病理改变；应用免疫荧光双标方法鉴定视网膜（切片）中AQP4阳性细胞的种类、检测各组大鼠视网膜（切片/铺片）中AQP4与早期内涵体标记物EEA1、晚期内涵体标记物甘露糖-6-磷酸受体（MPR）及溶酶体相关膜蛋白-1（LAMP1）的共表达，计数各组视网膜中AQP4阳性细胞及AQP4/EEA1、AQP4/LAMP1共表达细胞的数量，并计算及比较其比例。2.体外培养大鼠视网膜胶质细胞（加入层粘连蛋白,即laminin蛋白）及稳定转染AQP4的CHO细胞，使用免疫荧光染色方法检测两种细胞AQP4的表达；将每种细胞随机分为对照组、加压组。对照组不做任何处理，加压组在0.02MPa压力条件下培养3h,应用免疫荧光双标方法检测各组细胞AQP4/EEA1、AQP4/MPR及AQP4/LAMP1的共表达；使用钙黄绿素淬灭法（Calcein-quenching method）检测各组细胞水通透性的改变。结果1.高眼压10min后，各实验组大鼠视网膜含水量均较对照组增加(P＜0.05)，再灌注1h组视网膜含水量达到峰值92.76%，再灌注2h至4h短暂下降至86.33%(P＜0.05)，其后继续上升；HE染色结果显示实验组视网膜层次结构出现紊乱，呈水肿表现；免疫荧光双标记结果显示在正常视网膜中，AQP4+/GFAP+的星形胶质细胞位于神经纤维层和节细胞层，AQP4+/GS+（Glutamine synthetase）的Müller细胞胞体位于内核层。在高眼压5、10、30、60及90min组及再灌注0-12h大鼠视网膜GCL（及INL）内，均可见AQP4/EEA1的共表达，并且AQP4/EEA1共表达细胞在高眼压60min达峰值(72.97%±9.89%, P＜0.05)；在高眼压90min及再灌注12h未见AQP4／MPR的共表达，其它时间点均观察到AQP4／MPR的共表达；在高眼压后再灌注1、2、4、8、12h，可见到AQP4／LAMP1的共表达，再灌注4h，胶质细胞中AQP4/LAMP1共表达细胞的比例达到最大值（55.60%±13.03%，与相邻上一时间点相比，P＜0.05），此后共表达细胞比例逐渐减少。2.原代培养的大鼠视网膜胶质细胞，在20nM的层粘连蛋白（laminin蛋白）孵育条件下，其AQP4呈簇状表达于细胞膜上；稳定转染AQP4的CHO (Chinese hamster ovary,中国仓鼠卵巢癌)细胞，其AQP4呈线形均匀分布于细胞膜上；加压处理的胶质细胞及CHO细胞，可见胞膜上部分AQP4转移入胞质内，并与EEA1、MPR及LAMP1存在着共表达；与对照组相比,加压后的胶质细胞及CHO细胞水通透性分别下降49.02%及58.81%(P＜0.05)。结论1.急性高眼压及再灌注损伤可导致视网膜发生水肿，在该过程中视网膜胶质细胞所表达的AQP4内化进入早期内涵体及晚期内涵体，部分内化的AQP4可分选至溶酶体内降解。AQP4的内化／降解可能在视网膜水肿的发生、发展中起着作用，并可作为发展视网膜水肿治疗药物的靶点。2.压力因素可导致视网膜Müller细胞及稳定转染AQP4的CHO细胞膜上的AQP4内化进入早期内涵体及晚期内涵体，并且内化的AQP4可分选至溶酶体降解。AQP4的内化／降解导致细胞对水的通透能力下降，可能是细胞针对压力所致损伤的适应性反应。