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单核细胞增生性李斯特菌(Listeria Monocytogenes，LM)简称单增李斯特菌，为革兰氏阳性菌，寄生于宿主细胞内外，是一种重要的食源性人兽共患病病原菌，常引起人和动物，特别是反刍动物（如牛、羊等）的繁殖障碍，造成死胎、流产及胎儿感染，给养殖业带来重大的经济损失。近些年，人们对LM感染导致人和动物流产的发病机制进行了广泛的研究，证明LM感染引起的动物流产与其诱导的免疫失调和细胞凋亡有关，但具体机制尚不清楚。已知在妊娠动物的母胎界面上存在多种免疫调节细胞，如巨噬细胞和自然杀伤细胞等，这些细胞通过与存在于母胎界面滋养层细胞的相互作用，共同维持胚胎的正常发育、调节局部免疫的平衡和抵御外来病原的侵袭。近些年人们发现炎性体在介导局部炎性反应、抵御外来病原的侵入等方面发挥着重要的作用，证明许多病原菌可激活宿主单核/巨噬细胞的炎性体，后者可介导以炎性反应为特征的非特异免疫应答反应，然而过激的炎性反应可引起组织的损伤和相关疾病的发生。同时已有研究证明LM可激活巨噬细胞的炎性体，但是LM激活巨噬细胞炎性体的作用是否引起母胎界面的免疫失衡，是否影响滋养层细胞的功能，从而导致动物的流产，目前尚不清楚。为探讨LM感染引起动物流产的分子机制，本实验首先分析了LM感染对妊娠小鼠胚胎存活率和细胞因子表达的影响，结果显示，LM感染可大幅降低胚胎的存活率，明显提高Th1细胞因子（IL-2, INF-γ）和IL-1β表达，促进IL-1β成熟和释放。Th1细胞因子增加导致Th1/Th2细胞因子失衡和IL-1β介导的炎性反应均被认为是影响胚胎存活的重要因素。LM诱导IL-1β的成熟和释放提示LM可能激活了胎盘细胞中的炎性体，为此，本实验检测了妊娠小鼠胎盘组织匀浆液中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase1, caspase1)的水平，结果表明，LM可激活胎盘组织的caspase1。同时本实验采用溶血素O（listeriolysin O，LLO）缺陷型的LM（LM/LLO-/-）感染妊娠小鼠发现，LM/LLO-/-对妊娠小鼠胚胎存活率、细胞因子的表达和胎盘组织匀浆液中caspase1的水平没有产生明显的影响，表明在LM致妊娠小鼠流产的过程中，LLO通过激活炎性体发挥着重要作用。为大量制备LLO，本实验通过基因重组技术，构建了LLO的原核分泌表达载体，利用大肠杆菌表达和制备了重组LLO。溶血试验检测表明，制备的重组LLO具有明显的溶血活性，说明重组LLO具有生物学活性。为进一步证实LM对炎性体的激活作用，本实验首先用LM感染小鼠巨噬细胞，证实LM可明显促进IL-1β表达与释放，激活caspase1，促进感染细胞的凋亡和坏死，表明LM可激活巨噬细胞的炎性体。为了进一步弄清LLO在LM激活巨噬细胞炎性体的中的作用，我们用LM/LLO-/-和重组LLO处理B6巨噬细胞，通过激光共聚焦显微镜技术检测了LM/LLO-/-处理的细胞中组织蛋白酶B的分布，同时分析了重组LLO引起的K+外流和Ca++内流，结果证实细胞内LM产生的LLO可引起吞噬体/溶酶体膜的损伤导致组织蛋白酶B的释放，细胞外LLO可引起细胞膜通透性增加，促进K+的外流和Ca++的内流，组织蛋白酶B的释放和上述离子的流动被认为是NLRP3炎性体激活的重要因素。为进一步探讨LLO是否激活巨噬细胞的NLRP3炎性体中，我们分别用LM/WT、LM/LLO-/-和重组LLO处理小鼠B6巨噬细胞和NLRP3缺陷型（NLRP3-KO）B6巨噬细胞。结果发现：①L M/WT，并非LM/LLO-/-，可明显促进小鼠B6巨噬细胞IL-1β的释放，促进caspase1p10（成熟caspase1）的生成；LM/WT对NLRP3-KO B6巨噬细胞IL-1β的释放和caspase1p10生成的促进作用明显降低；②重组LLO处理后对IL-1β的释放和caspase1p10生成与LM/WT感染B6巨噬细胞的作用相似。上述结果表明，LM通过LLO可激活巨噬细胞的NLRP3炎性体。为探讨LM激活巨噬细胞炎性体是否影响对滋养层细胞的调节作用，本实验利用感染LM巨噬细胞的培养基和重组小鼠IL-1β在体外处理小鼠滋养层细胞，分析其对滋养层细胞的侵袭和炎性免疫应答的影响，结果表明感染LM的巨噬细胞的培养基和IL-1β均可促进滋养层细胞的侵袭，诱导滋养层细胞基质金属硫蛋白酶类（matrixmetalloproteinases, MMPs）的表达。这一结果表明，适度的IL-1β介导的炎性反应对滋养层细胞侵袭和胚胎着床是有力的，但如果炎性反应过激，由此造成的炎性损伤作用及滋养层细胞过度侵袭将会影响蜕膜的组织结构，影响胚胎着床和发育。同时，感染LM的巨噬细胞的培养基和重组IL-1β可促进滋养层细胞促炎性细胞因子（IL-6、IL-8、TNFα）和单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1, MCP-1）的表达，从而促进母胎界面的炎性反应，影响胚胎的正常发育和稳定性，这可能是LM诱发流产的又一重要因素。总之，本实验通过体内外实验，证明LM感染可引起妊娠动小鼠母胎界面Th1/Th2细胞因子的失衡，通过LLO成孔毒性作用可激活巨噬细胞NLRP3炎性体，引发caspase1介导的细胞凋亡和死亡，促进IL-1β释放及其介导的局部炎性反应；LM诱导巨噬细胞炎性体的激活对滋养层细胞的侵袭和炎性免疫应答反应有明显的促进作用。这项研究成果不仅为探讨LM感染引起人和动物繁殖障碍的分子机制提供了重要的实验依据，同时为该病的防治提供了潜在的靶位。