卵母细胞的玻璃化冷冻是保护物种资源有效手段,同时也可以为克隆等现代生物技术的研究提供大量的实验材料。由于猪卵母细胞对低温极其敏感,其玻璃化冷冻的研究进展十分缓慢。本实验以猪MⅡ期卵母细胞为研究对象,研究了几种玻璃化冷冻液对卵母细胞的毒性作用及不同冷冻载体、冷冻液对冷冻效果的影响,并通过体外受精对玻璃化冷冻后卵母细胞的发育能力进行检验,以探讨猪卵母细胞在玻璃化冷冻过程中的受损机制及体外受精的影响因素,筛选出较合适的冷冻液组合及载体,为进一步研究奠定基础。本研究主要包括以下主要内容：1.分别采用三种不同的冷冻液组合按照对应冷冻程序处理猪MⅡ期卵母细胞后不经冷冻进行孤雌激活培养,研究不同冷冻液组合对卵母细胞的毒性影响。2.分别采用三种不同的的冷冻液组合按照对应冷冻程序对猪MⅡ期卵母细胞采用GMP法进行冷冻,研究不同冷冻液组合对卵母细胞存活率的影响。3.选择效果最好的冷冻液组合,分别采用GMP和Cryotop为载体对猪MⅡ卵母细胞进行冷冻,研究不同载体对卵母细胞存活率的影响。4.通过FITC-PNA染色研究玻璃化冷冻对卵母细胞皮质颗粒分布的影响。5.分别对猪MⅡ期卵母细胞外卵丘进行不同处理后进行体外受精,研究卵丘细胞对体外受精的影响。6.通过对玻璃化冷冻后的猪MⅡ期卵母细胞进行孤雌激活及体外受精,研究玻璃化冷冻对卵母细胞后期发育能力的影响。研究结果表明：(1)3种冷冻液组合均对卵母细胞具有一定程度的毒性影响,其中ES3+VS3组(以TCM-199(Hepes)添加20%血清蛋白替代物(Serum protein substitute,SPS),15%EG,15%DMSO及0.5mo1/L蔗糖作为冷冻液)毒性最小。(2)采用ES3+VS3组冷冻液进行玻璃化冷冻的卵母细胞在形态正常率(82.31%),FDA染色活率(59.40%)及TB染色活率(62.18%)上均显著高于另外两组(p<0.05)。(3)以cryotop作为冷冻载体进行玻璃化冷冻的卵母细胞在形态正常率(96.67%),FDA染色活率(83.33%)及TB染色活率(86.67%)上均显著高于以GMP作为冷冻载体进行玻璃化冷冻的卵母细胞(p<0.05)。(4)经过玻璃化冷冻的猪卵母细胞皮质颗粒提前释放率(20.35%)显著高于未冷冻的卵母细胞(p<0.05)。(5)经消化去除全部卵丘细胞后的卵母细胞经体外受精后发育能力较差,卵裂率及囊胚率分别为30.26%和6.56%,与去除部分卵丘细胞的卵母细胞卵裂率及囊胚率(48.61%和17.09%)及保留全部卵丘细胞的卵母细胞卵裂率及囊胚率(49.95%和18.41%)的差异显著(p<0.05),证明了卵丘细胞在卵母细胞体外受精中起到重要的作用。