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木聚糖酶降解自然界中大量存在的木聚糖,在物质循环中起重要作用,它在造纸制浆、食品、纺织、饲料、能源工业中具有广阔的应用前景。但是,木聚糖酶要实现有效应用,要求木聚糖酶具有良好的酶学性质,在不同领域的应用要求木聚糖酶具有不同的酶学性质。因此开发新的木聚糖酶,获得高产木聚糖酶基因工程菌具有重要的意义。本文从Pleurotus ostreatus中将所克隆的木聚糖酶基因在毕赤酵母里进行了高效表达,研究了重组酶的酶学性质,为木聚糖酶的有效应用奠定了基础。
本研究先通过生物信息学的手段发现已知的真菌11家族木聚糖酶大多都有两个保守的氨基酸序列GKGWNPG和EGYFSSG,根据这两个序列,设计两条简并引物,成功地以Pleurotus ostreatus的染色体DNA为模板,扩增出木聚糖酶基因片段,并通过BLAsT比对发现这个片段编码新的木聚糖酶基因,然后构建基因组文库,通过基因组步行PCR的方法得到全长基因序列。经BLAST比对分析,该基因含有一个大小为52 bp的内含子,利用DpnI介导的外显子拼接的方法对含内含子的全长木聚糖酶基因进行剪接,获得该基因的全长cDNA,推测的氨基酸序列和已知木聚糖酶的最高一致性为70％。这也是从平菇中克隆到的第一个木聚糖酶全长基因。将克隆到的cDNA与经CpoI及NotI酶切后的毕赤酵母表达载体pHBM 905B连接后,构建成重组酵母表达载体PHBM3-G,重组子经线性化后转进宿主菌GS115中,经菌落PCR鉴定后挑选阳性转化子,在毕赤酵母GS115中进行了表达。重组酶经甲醇诱导表达后测得该酶的最适反应温度为55℃,最适反应pH值为6.6,在pH5.5-8.5维持50％以上的活性,该酶在70℃处理5min完全失活,在50℃和60℃处理10min,分别残余82.3％和41.0％的活性,对山毛榉材木聚糖具有最好的水解效果。金属离子的添加使重组酶活性降低,EDTA,β-巯基乙醇和DMSO对酶的活性基本没有影响,这提示着该酶不是一个金属酶,在工业生产中可能有着潜在的应用价值。