论文部分内容阅读
目的:探究慢性低氧肺高压大鼠肺微血管内皮细胞（Pulmonary Microvascular Endothelial Cells,PMVECs）上TRPV4通道及内皮通透性变化,明确TRPV4通道功能变化与内皮细胞通透性改变的相关性。方法:（1）清洁级雄性SD大鼠随机分为2组:正常对照组（CON）和慢性低氧组（CH）:大鼠饲养于氧分压为9.5%10.5%的密封有机玻璃箱内3W,3W后右心导管检查肺动脉平均压（RVSP）、右心重量指数（RVMI）,并用石蜡包埋切片HE染色法鉴定低氧模型是否成功;（2）组织块贴壁法培养原代CON组和CH组大鼠PMVECs,并用免疫荧光法及FITC-BSI结合试验鉴定PMVECs;（3）透射电镜检测CH组大鼠PMVECs间紧密连接变化;（4）用Millicell ERS-2测transwell小室电阻变化,确定单层的PMVECs汇合长满,再用异硫氰酸荧光素（FITC）标记葡聚糖法（Pd法）检测CON组与CH组大鼠PMVECs通透性,明确CH组大鼠肺微血管内膜通透性改变;另外再检测TRPV4的激动剂和抑制剂对单层PMVECs通透性的干预,明确TRPV4与PMVECs通透性改变间的相关性;（5）使用实时定量RT-PCR法检测TRPV4、TJ相关蛋白Occludin、ZO-1等在CON组和CH组大鼠肺微血管内膜中mRNA表达量的差异;（6）Western-blot检测PMVECs膜上主要钙离子通道TRPV4和主要的TJ相关蛋白Occludin蛋白表达水平,明确CH组PMVECs中TRPV4及TJ相关蛋白表达变化;（7）用Fluo-3荧光测Ca2+方法,测定CON及CH组大鼠PMVECs中[Ca2+]i的水平,明确CH-PH大鼠PMVECs基础该钙的改变;并检测TRPV4的特异性激动剂和抑制剂对PMVECs[Ca2+]i的影响,明确CH组基础钙的变化与TRPV4通道的相关性。结果:与正常组相比,（1）CH-PH模型大鼠的RVSP/mmHg（CON:27±2.61,CH:49±3.67,P<0.01）及对应的RVMI（CON:27.8±1.9,CH:47.3±2.3）均显著增高,肺小动脉血管壁平滑肌层明显增厚,管腔狭窄,提示CH-PH模型制备成功;（2）肺边缘组织块贴壁培养24 h有内皮细胞迁出,48 h后布满组织块周围,62 h后去组织,1 w左右长满培养瓶底70%以上,细胞形态从刚开始迁出的多边形变为铺路石样生长。免疫荧光技术显示vWF和CD31表达阳性,且FITC-BSI结合实验显示胞浆呈黄绿色荧光,提示成功培养出高纯度PMVECs;（3）透射电镜结果显示CH组大鼠PMVECs间紧密连接被破坏,且较CON组明显增大,提示CH组大鼠肺微血管内膜通透性升高;（4）TER法（transmembrane electrical resistance,TER）确定PMVECs汇合成单层后,用FITC-葡聚糖法检测通透性显示CH组Pd值（μl/cm2/h）显著增高（CON:12.5±1.87,CH:26.2±3.6,P<0.01）,GSK101预处理再测Pd值,显示Pd值显著增高,而HC-067则显著拮抗了GSK101引起效应,提示CH组PMVECs的通透性显著增高,且与PMVECs胞膜上的TRPV4密切相关。（5）CH-PH模型大鼠PMVECs中TRPV4、TJ相关蛋白Occludin、ZO-1等的mRNA表达和蛋白表达水平变化显著,其中mRNA表达水平:Occludin显著降低（CON:1.12±0.60,CH:0.19±0.13,P<0.01）、ZO-1 mRNA的表达也降低（CON:1.10±0.15,CH:0.35±0.10,n>6,P<0.01）、TRPV4显著增高（CON:1.02±0.25,CH:1.67±0.53,P<0.05）,另外蛋白表达水平:与mRNA表达水平一致,Occludin蛋白表达水平也显著降低,TRPV4蛋白表达水平显著增高,以上结果提示CH大鼠PMVECs胞膜上TRPV4 mRNA及蛋白表达水平显著上调,而TJ相关蛋白表达则下降;（6）CH组大鼠PMVECs中胞内钙（CON:107±6 nM,n>16;CH:137±30 nM,p﹤0.05）显著升高,提示CH-PH模型组大鼠PMVECs中基础钙明显增高;（8）此外,为了进一步了解PMVECs中TRPV4与血管通透性增加的内在联系,我们用TRPV4特异性激动剂GSK101测量[Ca2+]i同时检测它对血管通透性的影响,结果显示CH组的钙内流显著高于CON组,且PMVECs的通透性均显著增加;TRPV4特异性抑制剂HC-067对GSK101诱导引起的钙内流和通透性有显著拮抗作用。结论:（1）慢性低氧诱导PH大鼠肺微血管内皮细胞通透性增高,其主要的TJ相关蛋白Occludin、ZO-1等表达下调。（2）慢性低氧诱导PH大鼠肺微血管内皮细胞TRPV4通道mRNA/及蛋白表达水平及功能水平均上调。（3）TRPV4活化可显著增加单层肺微血管内皮细胞的通透性。本研究为肺高压发病机制的研究及治疗提供了全新的研究思路。