椎间盘退变是一系列脊柱退变性疾病的基本病理基础。椎间盘退变性疾病是临床常见的严重危害人群健康的疾病,其往往会导致继发的椎管狭窄、脊柱节段不稳、骨赘形成、腰腿痛及椎间盘突出造成的神经根和脊髓压迫,临床多见且病情复杂,影响患者的基本生活和生产劳动,甚至导致不同程度的残疾,造成劳动力丧失,给患者造成巨大痛苦,给社会带来沉重负担。退变导致相关疾病的治疗是临床医师所面临的一大难题。一般认为椎间盘退变从20岁即开始,缓慢进展,70岁时100%的人群有间盘的退行性改变,但只是程度不同和临床症状不同。调查表明,椎间盘退变导致的脊柱疾病带来的医疗费用与心脏病相当,高于糖尿病及肾脏疾病,但目前有限的治疗方法如椎板减压、椎间融合等高度侵入性手术并发症较多且远期疗效并不理想,并且这些治疗方法也只是对症治疗,无法达到根治该类疾病的目的,并不能扭转椎间盘退变过程。研究椎间盘退变的机制和逆转方法是根治椎间盘退变性疾病的主要策略。本课题旨在通过对导致椎间盘退变的应力因素的动态观察研究,通过完整的分子生物学调控通路研究宏观致病因素动态变化与微观病理学改变的相互关系。本课题在报道了人体髓核细胞体外动态压应力培养模型的基础上,利用课题组自行设计、研制的可用于不同细胞、不同压力条件的细胞压力培养的专用仪器装置(已获得国家专利,专利号: ZL200820030390.7)完成了人体髓核细胞最佳体外压应力刺激模型的建模工作,摸索并验证了人体髓核细胞体外动态压应力培养模型的最佳力学参数。本课题的目的在于建立实验室条件下的仿生的体外髓核细胞压应力培养模型,系统的观察动态压应力条件下的对人体髓核细胞形态和细胞骨架的影响作用;并通过完全仿生的髓核细胞压力模型,采用激光共聚焦、原子力显微镜、RT-PCR、western-blot、siRNA技术和免疫组化方法,阐明细胞骨架改变与NF-κB活化的关系和作用;压应力条件下NF-κB活化状态对髓核细胞Ⅱ型胶原表达的分子生物学调控机制,为该疾病的发病机理研究、生物治疗及防治策略的制定提供新的理论依据和实验基础。本课题的第一部分是动态压应力在人体髓核细胞体外培养中的作用和人体髓核细胞体外动态压应力培养模型的建立。利用已经成熟的髓核细胞的培养技术培养人体髓核细胞,使用本课题组研制的压力装置对培养的髓核细胞进行动态压应力刺激培养,参照文献(Ishihara H, McNally DS, Urban JP, et al. Effects of hydrostatic pressure on matrix synthesis in different regions of the intervertebral disk[ J ]. J App l Physiol, 1996, 80 (3) : 839 - 846.)并结合前期预实验结果,选取1~10Mpa区间内不同压力参数研究其对髓核细胞的影响,确定最佳制模参数;选择生长曲线变化明显且合理的状态作为动态压应力刺激培养的标准模型(最佳制模参数为2.5Mpa 1Hz 30min)。对不同力学环境下培养的细胞进行了组织学和形态学观察,比较和分析动态压应力环境对体外培养椎间盘细胞生长动力学的影响,了解不同强度动态压应力对髓核细胞凋亡的作用:从生长速率、MTT摄取、最大生长密度、分裂指数和克隆形成率等方面对应力刺激细胞模型进行生长动力学检测;流式细胞仪鉴定细胞的活性状态通过以上指标的观察和检测,对不同力学环境对髓核细胞体外培养的作用进行了初步评价。实验结果提示:1.髓核组织随着随着退变程度的增加,髓核组织逐渐丧失水分,含水量随着退变程度的加重而逐渐减少,透明度随着退变程度的加重逐渐降低2.动态压应力刺激后的细胞传代后的细胞贴壁时间明显缩短,一般于6h即可见大部分细胞贴壁,形态与原代细胞相似,但细胞的胞突略长(图2)。随着代次的增加,髓核细胞出现老化现象。一般细胞从传至第5代起,生长明显趋缓,细胞分裂指数明显低于3代细胞,从形态学角度观察发现细胞突起明显延长,逐渐趋向于梭形,胞质逐渐减少,丧失折光性,形态逐渐类似于成纤维细胞样。一般传至第7代时出现生长停滞。3.随着加力强度的增加,髓核细胞生长速度和最大生长密度均呈逐渐下降趋势,加力强度较之频率的增加对髓核细胞影响更加明显,于传代时即出现生长停滞。4.人体髓核细胞体外动态压应力培养过程中,细胞分裂指数、细胞克隆形成率与加力强度呈非线性的相关,适度的动态压应力刺激促进细胞分裂生长,反之对细胞的分裂生长以及功能代谢呈阻碍作用,甚至加速细胞死亡以及凋亡的进程。5.各实验组在不同的动态压应力刺激下,1Mpa组与常压对照组没有统计学差异;当应力强度大于5Mpa时,细胞各生长动力学指标均明显低于常压对照组;2.5Mpa组与常压对照组和其他各实验组在细胞分裂指数等细胞生长动力学指标的比较中具有显著的统计学差异,说明该压力值对于促进髓核细胞体外生长和代谢功能具有明显作用,符合制模最佳参数基本要求。本课题的第二部分是动态压应力环境下体外培养人体髓核细胞微管结构改变对NF-κB通路的活化作用。实验通过研究体外培养人体髓核细胞微管结构在动态压应力作用下的形态学改变初步阐明了动态压应力对人体髓核细胞体外培养模型微管结构的作用和影响。实验发现经2.5Mpa动态压应力作用后的髓核细胞在高倍镜下可见细胞结构变化明显,未见明显细胞死亡,24小时后细胞微管结构逐渐恢复;其余各组细胞结构变化明显,死亡细胞较多,24小时后细胞结构无恢复。经微管阻断剂预处理的髓核细胞经过加力作用后细胞形态学结构没有明显变化,β-tubulin染色荧光亮度值明显低于其他实验组。EMAS、RT-PCR和western-blot结果显示2.5Mpa动态压应力作用后的人体髓核细胞NF-κB基因和蛋白的表达量均高于对照组和其他各实验组。本部分实验结果提示:1.动态压应力对体外培养的髓核细胞的微管结构具有显著的活化作用;不同强度的动态压应力对髓核细胞微管结构的活化作用不同;髓核细胞的微管结构活化状态与动态压应力的强度呈非线性对应关系,2.5Mpa 1Hz的动态压应力对体外培养的人体髓核细胞微管结构具有最佳活化效果,当力的强度大于5 Mpa时对于微管结构的作用变为不可逆。2.不同强度的动态压应力对人体髓核细胞微管结构的活化状态与NF-κB基因和蛋白的表达量呈正相关关系。3.阻断微管结构后,动态压应力对髓核细胞的作用效果受到影响:微管结构变化不明显,NF-κB基因和蛋白的表达量均低于对照组和各实验组。4.不同强度的动态压应力通过改变人体髓核细胞的微管结构活化状态调节NF-κB基因和蛋白的表达量,进而达到调控NF-κB下游基因和蛋白的目的。本实验的第三部分是体外培养人髓核细胞在动态压应力作用下NF-κB活化对Sox9基因和II型胶原基因表达的调控作用。实验通过采取RNA干扰技术,经过病毒载体构建、体外筛靶实验、内源验证实验等实验手段对体外培养的髓核细胞的NF-κB基因的有效作用靶点进行了筛选和验证,构建pFU-GW-RNAi对NF-κB基因进行了抑制,同时通过RT-PCR和western免疫印迹等实验方法对下游的Sox9基因和II型胶原基因的表达情况进行了研究。实验发现,人髓核细胞中基因序列中存在多个有效的的病毒干扰靶点,选择后作为后继慢病毒包装靶点进行大量病毒包装后感染髓核细胞,检测下游Sox9基因和Ⅱ型胶原基因的表达情况发现,NF-κB经过siRNA作用后Sox9基因和Ⅱ型胶原基因呈现显著的表达降低。本部分实验结果提示:1.人体髓核细胞的NF-κB基因存在多个可被敲减的基因作用靶点。2.体外培养的人体髓核细胞在动态压应力作用下,NF-κB通道的活化对Sox9基因和Ⅱ型胶原基因具有正向相关调控作用。3.体外培养的人髓核细胞NF-κB基因经过siRNA作用后,Sox9基因和Ⅱ型胶原基因的表达量显著降低。本课题立足于我们既往的研究结果,着眼于宏观病因学和微观病理学改变的联系,重点阐明动态压应力通过细胞骨架的改变活化NF-κB通路对椎间盘髓核细胞Sox9基因和Ⅱ型胶原表达的分子生物学调控机制,有助于帮助我们深入了解椎间盘退变性疾病的发病机理,进而为该类疾病的分子生物学治疗找到以NF-κB通路相关蛋白和Sox9基因为基础的基因治疗靶点。对于深入认识该类疾病的发生和发展机理,制定防治策略具有重要意义。