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苹果黑星病是世界各苹果产区的重要病害之一,主要为害叶片和果实,造成叶片早期脱落,树势降低,受害果实开裂畸形,失去商品价值。在我国,苹果黑星病仅在局部地区小范围内发生,是国内检疫性病害。近几年,随着病害的不断扩展蔓延,发病面积逐年扩大,严重威胁我国苹果产业生产的可持续发展。1997 年该病害首次在陕西兴平、礼泉、杨陵、旬邑等地发生,是陕西省苹果生产中的新病害。本文应用SSR分子标记技术对苹果黑星病菌的遗传多样进行了研究,取得了以下结果: 1. 建立了Squash-Blot 提取苹果黑星病菌基因组DNA 的规范化方法。该方法技术简单,易于操作,省工省时,降低了有毒试剂对实验操作者的危害,对仪器设备和试剂的要求都不高,一个人一天可提取一百多个样,使得DNA的提取从用菌丝提取需要一个多月减少为用病斑提取只需几天的时间,大大加快了实验的进程。 2. 对苹果黑星病菌SSR 的反应体系进行了优化,建立了最适反应体系:25 μL 体系中,10×Buffer(MgCl2 20 mmol/L)2.5 μL,dNTP 100 μmol/L、引物0.5 μmol/L、Taq DNA聚合酶1.5 U,DNA模板2 mg/L , ddH2O 19.5 μL。PCR 扩增程序为93 ℃,2 min,57 ℃,30 s,1 个循环;72 ℃,1 min, 93 ℃,30 s,57 ℃,30 s,40 个循环;72 ℃,10 min。经多次扩增实验证明,该反应体系重复性和稳定性良好。 3. 采用SSR 分子标记技术分析了来源于中国陕西、英国和印度共160 个苹果黑星病菌株的遗传多样性。结果表明,中国与英国、印度大部分菌株间的遗传关系较近,但也有部分印度菌株,如RD1、G1-10、R1-1、G2-8、G1-2、R1-12 与英国菌株、中国陕西菌株间的遗传差异较大。同一地域内菌株间的遗传差异与生境无明显的相关性,菌株间的遗传差异与苹果不同品种之间无明显的相关性。 该研究结果对认识我国苹果黑星病菌的遗传多样性具有重要理论意义,对合理开展针对苹果黑星病防治、抗源选择、病菌传播路线和毒性变异规律提供了基本的理论依据,为探索控制其毒性变异及指导其防治工作提供理论依据。