研究背景糖尿病等疾病所引起的难愈性皮肤溃疡是临床治疗的难点。延迟愈合的创面还容易形成增生性瘢痕，从而导致机体的功能障碍。目前，难愈性皮肤溃疡的治疗依然是整形外科临床面对的挑战之一。因此进一步明确难愈性皮肤创面愈合的机理，促进其早期修复是创伤研究领域的焦点问题。皮肤创面的愈合是一个由多种细胞和细胞因子共同参与，并且涉及到炎症反应、肉芽形成、血管生成和组织重塑的复杂的病理生理过程。而慢性创面的主要特征是持续慢性炎症，肉芽组织和血管形成减少，细胞因子缺乏，低氧状态和血供障碍。目前认为在糖尿病创面中，高浓度的TNF-α过度激活NF-κB是创面延迟愈合的一个重要因素；有研究证据表明抗TNF-α治疗在减少糖尿病的并发症方面是有益的。目前大量的研究证实了骨髓间充质干细胞在皮肤创面的愈合过程中起到重要的作用。但骨髓间充质干细胞参与上皮化愈合的过程和调控机理还不清楚，向临床应用转化尚有距离。同时在慢性皮肤溃疡创面中，骨髓间充质干细胞聚集和角质细胞转化障碍是创面难愈合的重要原因。成纤维细胞合成功能下降和对生长因子的反应性降低也是造成慢性创面难愈的重要因素，但成纤维细胞老化和失活的确切原因，迄今还不完全清楚。我们推测在糖尿病等慢性创面中，TNF-α过度激活NF-κB信号通路导致成纤维细胞功能低下，趋化因子缺乏是影响间充质干细胞迁移到创面和参与上皮化愈合的重要影响因素。阻断TNF-α的作用，能够改善成纤维细胞功能，促进内在的间充质干细胞和移植的间充质干细胞参与创面的上皮化愈合过程。目的本研究拟重点研究TNF-α/NF-κB信号通路对成纤维细胞活性及功能的影响；阻断NF-κB信号通路后对骨髓间充质干细胞参与糖尿病小鼠创面愈合作用的影响，趋化因子SDF-1-α水平对骨髓间充质干细胞功能、迁移和创面愈合的影响；探索其相关性，揭示间充质干细胞参与糖尿病创面愈合的影响因素和可能机制，为慢性创面治疗提供新的靶点和理论依据。方法1、用TNF-α刺激体外培养的成纤维细胞，研究TNF-α激活NF-κB途径对成纤维细胞的增殖和细胞周期影响，同时检测SDF-1α的变化。2、采用链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病小鼠建立全层皮肤缺损的创面模型。分离培养小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)。实验动物分为4组：①NC组：正常对照组；②DC组：糖尿病对照组；③MSC1组：糖尿病注射MSC；④MSC2组：糖尿病注射MSC，同时腹腔注射PDTC。在创缘注射移植MSCs，全程观察创面愈合情况；然后分别在术后第3、7、11、14天切取创面组织，进行组织染色，观察创面中胶原生成、NF-κB、VEGF表达等指标。同时检测创面组织中SDF-1α的变化。结果1、TNF-α能够影响培养成纤维细胞的增殖和细胞周期。TNF-α作用下成纤维细胞SDF-1α分泌水平呈现降低趋势，而阻断NF-κB信号则能促进SDF-1α分泌。2、PDTC通过阻止IκB亚单位的降解，抑制NF-κB活化，从而阻断NF-κB信号通路的激活。3、小鼠腹腔注射STZ诱导糖尿病，皮肤创伤后成功建立延迟愈合的糖尿病小鼠创面模型。4、跟踪观察发现，注射PDTC的干细胞治疗组愈合率与正常小鼠一致，优于糖尿病对照组和干细胞治疗组(P＜0.05)。5、实验小鼠创面组织HE和Masson染色可见，阻断NF-κB信号通路可减少糖尿病小鼠创面炎性细胞浸润时间，促使创面的肉芽组织、成纤维细胞和新生血管生成，同时胶原生成增多。6、阻断NF-κB信号通路能够有效增加创面愈合过程中VEGF表达和SDF-1α水平。7、GFP荧光示踪发现，注射PDTC之后，创面内移植骨髓间充质干细胞GFP阳性细胞数及IOD值明显大于对照组(P＜0.05)。结论1、一定浓度范围的TNF-α具有促进成纤维细胞增殖能力的作用，通过阻断NF-κB信号通路后，TNF-α的促增殖作用受到抑制。2、PDTC阻止IκB亚单位的降解，抑制NF-κB活化，同时也阻碍NF-κB向细胞核内的转移，从而阻断NF-κB信号通路的激活。3、TNF-α作用下成纤维细胞SDF-1α分泌呈现降低趋势，而阻断NF-κB信号则能促进SDF-1α分泌。TNF-α的作用与其浓度呈负相关。4、在糖尿病小鼠皮肤创面边缘注射移植MSCs，对创面愈合有明显的促进作用，而阻断TNF-α/NF-κB信号通路可以使这一作用增强，同时能够改善创面微环境，减少炎性细胞浸润时间及过度炎症反应，促使创面的成纤维细胞增殖、肉芽组织和新生血管生成、胶原生成增多，最终加速创面愈合。