研究目的多发性骨髓瘤（MM）是一种以单克隆浆细胞恶性增殖为特点的血液系统肿瘤,目前仍无法治愈,迫切需要开发具有不同作用机制的新药物,优化治疗效果,以降低疾病复发风险并加深反应持久性。天然产物是现代药物开发的主要资源,寻找和开发高效低毒的天然植物药物是MM相关临床药物研发的方向之一。大量的研究结果显示,恶性浆细胞在骨髓微环境中的生存和增殖依赖于非恶性细胞成分。其中,肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）主要表现为M2样巨噬细胞特征,与肿瘤的存活、复发、转移等生物学特性密切相关。中药兴安升麻在我国被广泛的应用于临床,课题组前期将以升麻为君药的升麻鳖甲汤加减方作为研究对象,发现其可以抑制骨髓瘤生长。但兴安升麻对MM的作用及其分子生物学机制尚未阐明。我们以公共数据库单细胞测序数据分析为基础,在体内及体外两个层面开展了一系列研究,以求能够清楚地揭示中药兴安升麻水提物（CRAE）对于MM的抗肿瘤作用机制,为升麻及以升麻为主要组成的中药复方的临床应用提供理论依据。研究方法1.公共数据库临床样本生物信息学分析从GEO数据库获取GSE163278数据集中的11例MM患者骨髓样本scRNA-seq数据信息。对数据进行质量控制,通过RPCA分析法整合UMI计数矩阵,使用R软件包Seurat对每个细胞的基因表达进行标准化,然后进行对数转化。接着对数据进行降维分析与聚类分析,之后对样本M1样与M2样巨噬细胞基因富集特征进行分析。我们从已公开发表的文献中确定M1样和M2样巨噬细胞特征表达基因,应用Seurat中的AddModuleScore函数计算巨噬细胞群中的富集分数,在热图和小提琴图中进行比较。2.体内实验1)CRAE联合硼替佐米对裸鼠肿瘤生长的影响经过7天的适应性饲养后,随机选择8只BALB/c裸鼠作为空白组,其余32只作为实验组,实验组裸鼠进行SP2/0细胞移植肿瘤模型造模。随后将实验组裸鼠随机分为4组:模型组、CRAE组、硼替佐米组、联合治疗组,共5个组别,连续干预21天,在造模第53天,对裸鼠实施安乐死,获取肿瘤组织并称重,解剖分离肝脏、脾脏和肾脏,用于WB检测、IHC染色和HE染色。2)CRAE对多发性骨髓瘤裸鼠皮下移植瘤模型中TAMs的影响获取SP2/0细胞裸鼠移植瘤模型各组肿瘤组织,应用IF、IHC检测肿瘤组织中巨噬细胞相关蛋白表达情况,应用磁珠分选技术对肿瘤组织中的巨噬细胞进行分离,WB检测巨噬细胞相关蛋白水平。3)CRAE对M2-BMDM巨噬细胞极化的影响提取C57BL/6健康小鼠股骨骨髓来源巨噬细胞（BMDM）,经过M-CSF、IL-4和IL-13的定向分化后获得BMDM来源的M2样巨噬细胞（M2-BMDM）,并用不同浓度的CRAE对M2-BMDM进行处理。流式细胞术对CD86+/CD206+细胞进行检测,ELISA法检测各组培养液TNF-α、IL-12水平。4)体内清除巨噬细胞验证CRAE介导的抗肿瘤作用经过7天的适应性饲养后,选择20只BALB/c裸鼠作为实验组并进行SP2/0移植肿瘤模型造模,应用脂质体氯磷酸盐（CL）清除裸鼠体内巨噬细胞,并以PBS脂质体（PL）作为阴性对照,将裸鼠随机分为4组:模型组、CRAE组、CRAE+PL组、CRAE+CL组,共4个组别,连续干预21天,在造模第31天,对裸鼠实施安乐死,获取肿瘤组织并称重。3.体外实验1)CRAE对体外构建的共培养体系中TAMs不利分化的影响采用Transwell共培养法构建由PMA分化的人THP-1细胞和人骨髓瘤细胞株H929体外共培养体系,流式细胞术、WB、IF观察CRAE对共培养体系中TAMs分化的影响。2)CRAE对体外构建的共培养体系中TAMs炎症相关信号通路的影响WB检测CRAE对体外共培养体系中TAMs炎症相关信号通路TLR4-MyD88-NF-κB信号通路的主要效应蛋白水平,分别应用TLR4蛋白抑制剂TAK-242和NF-κB抑制剂Bay 11-7085进行验证,IF观察各组p65的入核转录情况。3)CRAE处理的巨噬细胞对体外构建的共培养体系中骨髓瘤细胞生长的影响流式细胞术、TUNEL法检测CRAE处理的巨噬细胞对体外共培养体系中骨髓瘤细胞株H929细胞凋亡的影响。4)CRAE中的化学成分鉴定与CRAE-TLR4结合位点分析应用UHPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS法分析CRAE化学成分,并采用分子对接技术对CRAE中可能与TLR4结合的化合物和结合位点进行预测。研究结果1.公共数据库临床样本生物信息学分析1 1个MM患者样本中巨噬细胞差异性表达基因前十位分别为MS4A7、SERPINA1、IFITM3、CFD、LST1、AIF1、FCGR3A、COTL1、SAT1、FIH1。差异表达基因主要参与中性粒细胞活化及免疫应答、中性粒细胞脱颗粒、T细胞活化等过程,主要参与破骨细胞分化、抗原处理和呈递、吞噬体相关通路等途径。样本中存在高M2样巨噬细胞活性,M2样特征基因的表达较M1样特征基因的表达更高。2.体内实验1)CRAE组平均肿瘤体积和肿瘤重量显著小于模型组。硼替佐米的抑瘤效果优于CRAE,而联合治疗组的抑瘤效果则更强。Kaplan-Meier生存曲线显示CRAE能在一定程度上延长荷瘤裸鼠的生存时间。各组裸鼠体重没有明显差异,CRAE没有造成明显肝脏、脾脏和肾脏的损伤。2)CRAE组和联合治疗组的F4/80+CD86+细胞百分比显著升高,M2样巨噬细胞标记物（Arg1和CD163）的表达水平显著降低,而M1样巨噬细胞标记物（iNOS和CD86）的表达水平显著升高。3)CRAE可显著增加M2-BMDM中CD86+细胞比例,降低CD206+细胞比例。与对照组相比,经CRAE处理的M2-BMDM培养基中的TNF-α、IL-12水平显著增加。4)当巨噬细胞耗尽时,CRAE抑制肿瘤生长的作用被显著减弱。与模型组相比,CRAE组和CRAE+PL组的体重略高。3.体外实验1)CRAE处理后,TAMs的形态发生明显变化,伪足延长,细胞呈长梭形。CRAE组CD86+细胞比例增加,而CD163+细胞比例减少。CRAE组巨噬细胞的M1样巨噬细胞特征蛋白iNOS、CD86的水平升高,而M2样特征蛋白CD163、Arg1的水平降低。2)CRAE组TLR4、MyD88及TAK1的磷酸化水平升高,下游磷酸化蛋白p-IKKβ、p-IκB和p-p65水平升高。CRAE干预后,p65的红色荧光强度增加,细胞核中的表达以剂量依赖性方式显著增加。应用TAK-242和Bay 11-7085后,CRAE的上述作用被显著削弱。3)与TAMs共培养的H929细胞凋亡率以CRAE处理TAMs的剂量依赖性增加。4)分子对接结果显示CRAE中的升麻酸B可以与TLR4蛋白结合,与TLR4蛋白GLN 333、SER 352和LEU283氨基酸残基形成三个氢键,有可能通过与靶蛋白结合影响TLR4活性。结论CRAE的活性成分引起TLR4的激活,通过TLR4-MyD88-TAK1-NF-κB轴引起NF-κB的激活,促进骨髓瘤相关巨噬细胞的重编程,改善骨髓瘤肿瘤微环境,进而诱导骨髓瘤细胞发生凋亡。