水牛转基因克隆技术对水牛的遗传改良具有重要意义。有研究指出，去透明带后的手工体细胞核移植技术的操作效率及囊胚发育率显著高于显微操作的体细胞核移植技术。但水牛徒手克隆技术平台的建立仍未取得实质性进展，本研究从去核、融合、培养液、培养方法等方面优化并建立水牛的徒手克隆技术平台并分析卵胞质的量影响胚胎发育的机制，同时研究了小分子抑制剂UNC0638对水牛转基因细胞外源基因表达及阳性率的影响，以期建立稳定高效的水牛徒手克隆转基因技术平台。　　1.探讨了水牛成熟卵母细胞去核、重构胚融合、胚胎培养液、胚胎培养方法、微穴大小等相关影响因素，以建立稳定的水牛徒手克隆技术平台。结果显示:成熟培养22～24h的水牛卵母细胞，经0.5μg/ml秋水酰胺处理15min后可获得较高的核突起效率(93.67±6.2％)，且后期的孤雌胚胎分裂率和囊胚率(83.33±7.1％，22.22±1.7％)与未处理组(84.78±4.9％，28.26±1.6％)不存在显著差异(P＞0.05)。经手工切割去核胚胎的卵裂率和囊胚率与纺锤体观测系统(Spindle view)引导去核组不存在显著差异(P＞0.05)。融合参数设置为（1.0kV/cm，10μs，两次脉冲）时，徒手克隆重构胚可获得较高的融合率(91.39％)且囊胚率(12.90％)显著高于融合参数为（2.0kV/cm，15μs，三次脉冲）和（2.0kV/cm，10μs，两次脉冲）组(P＜0.05)。在比较不同培养液对克隆重构胚发育的影响时，发现RVCL组分裂率与囊胚率(84.62±2.6％，25±0.6％)与mRVCL组(73.97±7.9％，24.66±4.1％)不存在显著差异（P＞0.05），囊胚率均显著高于M199培养组(2.80±1.8％，P＜0.05)，但RVCL组囊胚阶段细胞总数显著低于mRVCL组(49±3vs75±8，P＜0.05)。微穴(WOW)培养无透明带徒手克隆胚胎的囊胚率显著高于平面培养(FS)组和微滴培养(MD)组（24.66±4.2％vs6.82±3.0％，8.33±4.1％，P＜0.05）;微穴大小影响胚胎的发育，较小的微穴对无透明带胚胎的发育具有促进作用(34.85±1.8％vs24.66±4.2％,P＜0.05)。　　2.研究了受体卵胞质的量对水牛克隆胚胎发育的影响，并对其影响的分子机制进行初步分析。结果发现，三半卵胞质构建的重构胚其卵裂率显著高于单半卵胞质组与双半卵胞质组（86.75±2.7％vs69.23±8.8％，71.83±6.5％，P＜0.05），且其囊胚发育率(27.94±1.6％)及囊胚阶段总细胞数(169±12)显著高于单半卵胞质组(17.95±3.1％，85±6;P＜0.05），但与双半卵胞质组(25.35±2.0％，150±10)不存在显著差异(P＞0.05)。地衣红染色结果显示:三半卵胞质与双半卵胞质组的克隆胚胎在融合后1.5h，其核膜破裂与染色体凝集效率均显著高于单半卵胞质组(P＜0.05)，但融合后3h，三试验组的核膜破裂及染色体凝集率不存在显著差异（P＞0.05）。免疫荧光染色结果发现:单半卵胞质克隆胚胎在2-cell和4-cell阶段的DNA甲基化水平显著高于体外受精胚胎和三半卵胞质胚胎(P＜0.05)。JC-1染色结果显示:体外受精胚胎的膜电位显著高于克隆胚胎组(P＜0.05)，三半卵胞质组膜电位在2-cell与囊胚阶段显著低于单半卵胞质组(P＜0.05)，但4-cell与8-cell无显著差异（P＞0.05）。RNAPolⅡ蛋白免疫组化结果发现:单半卵胞质组与三半卵胞质组的克隆胚胎均在4-cell阶段可观察到RNAPolⅡ蛋白的表达但滞后于IVF胚胎组。合子基因启动标志基因(eIF1A，U2AF)在体外受精及克隆胚胎发育过程中有着相似的表达规律，均在胚胎发育的8-cell阶段表达量最高，囊胚阶段下降;8-cell期三半卵胞质组胚胎基因组激活(EGA)相关基因（eIF1A和U2AF）的表达显著高于单半卵胞质组。　　3.试验对一例终止妊娠的转基因徒手克隆水牛胎儿进行了分子生物学鉴定，同时对外源基因在转基因克隆水牛各组织间差异表达的原因进行分析。分别提取流产的徒手克隆水牛各组织（心脏、肾脏、肺、肝脏）DNA进行PCR检测。结果发现，各组织均可扩增到679bp的eGFP片段和497bp的Neo片段。提取耳部与胎盘组织的RNA进行RT-PCR，发现耳部组织可扩增到679bp的eGFP片段和497bp的Neo片段，但胎盘组织未检测到外源基因的表达。进一步使用绝对定量PCR检测转基因水牛各组织（心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏）外源基因的拷贝数的结果显示，心脏(2.67±0.04)、肝脏(2.76±0.14)、脾脏(3.10±0.13)、肺(1.97±0.14)、肾脏(3.45±0.08)，外源基因拷贝数在转基因克隆水牛各组织中存在显著差异(P＜0.05)。重亚硫酸氢盐—测序法检测CMV启动子的DNA甲基化水平结果发现，各组织外源基因CMV启动子区域发生了大范围的DNA甲基化(脾脏57.9％、肺89.5％、肝94.9％、心脏78.9％、肾脏100％)，与转基因供体细胞(7.89％)相比存在显著的差异(P＜0.05)，且各组织间DNA甲基化水平也存在显著差异(P＜0.05)。　　4探讨了不同浓度UNC0638处理水牛转基因胎儿成纤维细胞后对外源基因表达及转基因细胞阳性率的影响。结果发现，适宜浓度UNC0638处理水牛胎儿成纤维细胞对其核型无显著影响，但浓度达到5μmol/L时抑制细胞的增殖。荧光免疫组化技术分析结果显示:不同浓度UNC0638（0、0.5、1.5、2.5、5μmol/L）处理水牛胎儿成纤维细胞48h后，各处理组与对照组相比，细胞的H3K9me2甲基化水平显著降低（P＜0.05）。不同浓度UNC0638（0、0.5、1.5、2.5μmol/L）分别处理水牛转基因胎儿成纤维细胞不同时间(24、48h)，Q-PCR检测eGFP的相对表达量发现，各处理组在48h与对照组相比eGFP的表达量显著提高（P＜0.05）。流式细胞仪检测结果显示，UNC0638浓度为1.5μmol/L处理48h细胞阳性率显著高于对照组（P＜0.05），而其他各组间细胞阳性率无显著差异（P＞0.05）。　　以上结果表明:(1)优化的水牛徒手克隆技术方法是采用0.5μg/ml秋水酰胺诱导水牛卵母细胞去核，1.0kV/cm、10μs的两次脉冲融合参数进行电融合，微穴培养（规格参数:334μm，334μm）与mRVCL培养液可应用于水牛徒手克隆胚胎的培养;(2)受体胞质的量影响克隆胚胎的发育，增加受体胞质的量后可降低克隆胚胎DNA甲基化水平，加快供体核入卵后核重塑的过程并提高核重塑的效率，且提高合子基因的表达，从而有利于水牛徒手克隆胚胎的发育;(3)转基因克隆水牛组织间出现外源基因的差异表达可能与外源基因拷贝数和启动子DNA甲基化水平存在显著差异有关;(4)水牛转基因胎儿成纤维细胞经1.5μmol/L UNC0638处理48h后可提高外源基因eGFP的表达量和转基因细胞的阳性率。