目的：毛冬青为冬青科植物毛冬青(Ilex pubescens Hook.Et Am.)的干燥根,具有清热解毒、活血通络的功效,临床上广泛应用于治疗冠心病、心绞痛和脉管炎等疾病。是华南地区的民间常用药。毛冬青生长周期长且以根部入药,资源再生能力差。现阶段人工栽培较少主要依赖野生资源供给市场需求,野生资源蕴藏量逐年下降。目前市售药材中已经普遍存在茎枝混用的现象,部分商贩将秃毛冬青(Ilex pubescens var. glabra)作为毛冬青入药使用。密苏里植物园(Missouri Botanical Garden)于2012年将秃毛冬青作为毛冬青同物异名进行处理,新版中英文《中国植物志》亦未收载该品种。因此明确毛冬青种质资源,建立精准、快捷有效的鉴别方法势在必行。方法：本研究采用ISSR分子标记对华南5省的毛冬青样品进行鉴定,尝试从分子水平上对毛冬青和秃毛冬青进行区分,明确毛冬青药用植物基源；采用高效液相法对毛冬青内不同部位,不同采收时间的样品中特征性成分进行分析,在实现快速鉴定的同时为毛冬青的大范围规范化种植奠定基础。结果：1.建立蛋白酶K-mCTAB法用于毛冬青cDNA的提取,采用CTAB free的缓冲液A对液氮粉碎后的毛冬青组织进行抽提,去除大部分酚类和部分水溶性次生代谢产物,加入蛋白酶K提升了核酸产率的同时减少蛋白杂质污染。实验结果显示,采用优化后的方法毛冬青cDNA产率较DP305试剂盒提取结果提升最少4倍,且纯度高、带型完整,能够满足后续实验要求。2.采用正交设计法对毛冬青ISSR反应体系进行优化,最终优化结果为Mg2+:2.5 mmol·L-1, dNTPs:0.15 mmol·L-1, Primer:0.4 μmol·L-1, DNA:70 ng, Taq:0.5 U,共筛选11条引物及退火温度用于后续研究。28个样品共扩增出条带2531条,平均每个引物扩增出230.1条,其中多态性条带1870条,占比74%,平均每个引物170条。3.28个样品的相似系数介于0.6478-0.9870之间,平均相似系数为0.7693。其中来自广东省乐昌市的A5与来自广东省梅州市平远县芋麻神下的A27相似系数最小为0.6478差异最大；来自广东省梅州市平远县牛神坑的A24与广东省梅州市平远县芋麻神下的A27样品相似系数最高为0.9870相似度最高。秃毛冬青样品与其他样品相比存在明显的差异。所有样品主要遗传距离主要分布在0.75-0.775范围内,秃毛冬青组间遗传距离主要分布在0.725-0.75之间,内遗传距离主要分布在0.8-0.825之间。UPGMA法聚类分析结果显示秃毛冬青在0.34水平上与毛冬青形成明显的分支,证明筛选出的11条ISSR引物能够在分子水平上对毛冬青和秃毛冬青进行区分。4.基于28份基因池扩增结果,经筛选,去除出现概率<18%的序列建立毛冬青ISSR指纹图谱。采用5份随机毛冬青样品和5份随机秃毛冬青样品的验证试验显示：5个毛冬青样品扩增结果与毛冬青ISSR指纹图谱相似度介于0.8371-0.8962,5个秃毛冬青样品扩增结果与毛冬青ISSR指纹图谱相似度介于0.6831-0.7411.证明毛冬青ISSR指纹图谱能够对毛冬青和秃毛冬青进行区分。5.高效液相法对不同部位样品检测结果显示：ilexsaponin A1含量根>茎>细枝,ilexsaponin B1含量细枝>根>茎。其中ilexsaponin A1含量根中含量比例为的45%-66%以上,细枝含量最低,含量比例为6%-27%,茎含量介于两者之间,为27%-39%。ilexsaponin B1含量细枝中含量比例最大,达到56%-75%,茎中含量最低,为10%-15%,根中含量介于两者之间,为15%-30%。不同植株间虽存在一定的个体差异,但是其总体趋势相同。针对不同采收时间样品的研究显示ilexsaponin A1, ilexsaponin B1两个目标成分的含量随时间变化存在有规律的波动,其规律为：ilexsaponin A1在5-7月出现全年含量的最低值,在9月出现含量最大值,ilexsaponinB1在一年中会出现两次含量高峰,一次出现在5-7月,另一次出现在11月。DP002和DP003两个样本中ilexsaponin A1, ilexsaponin B1含量的变化趋势基本一致。结论：基于ISSR分子鉴定的研究结果显示,本实验筛选出的11条引物能够将毛冬青和秃毛冬青进行明显区分,证明两者在分子水平上存在差异,结合前人化学研究,有必要对秃毛冬青能否入药毛冬青进行深入研究。建立了毛冬青ISSR指纹图谱,并对其准确性进行验证,证明其够实现毛冬青的鉴定。选取毛冬青中含量较大ilexsaponin A1, ilexsaponin B1两个三萜类化合物对同株不同部位和不同采收时间的成分含量进行分析,结果显示两个化合物在植物不同部位含量的存在较大差异,其全年内含量变化也存在规律性波动,为后期毛冬青三萜类化合物合成通路研究提供思路和依据。