引言：高胆固醇血症是动脉粥样硬化(AS)重要的危险因素之一，可通过诱导局部炎症反应、氧化应激损伤、损害血管内皮细胞代谢和功能等诸多作用，最终导致AS的发生发展。但迄今为止，高胆固醇血症诱导产生AS的具体机制仍未明了。血管内皮细胞生长因子(VEGF)是血管内皮细胞和平滑肌细胞合成分泌的糖蛋白，是体内促血管生长和调节血管内皮细胞通透性的主要细胞因子。研究显示，在高胆固醇血症患者及实验动物模型中，其VEGF水平可明显升高[1-3]；但并非所有的研究都能得到相同的结果[4，5]。有研究表明，VEGF的上调有助于维持血管内皮细胞功能紊乱时血管壁内外物质交换的动态平衡[6]，但也有研究提示，VEGF过表达可增加内皮细胞的通透性，促进脂蛋白及炎症细胞进入动脉内膜下，诱导和促进AS早期病变的发生和发展，因此，VEGF也可能参与了AS的形成[7-10]。还有学者提出，VEGF介导的血管生成是导致AS斑块发展的必要充分条件[11]。但高胆固醇血症对血管内皮细胞VEGF合成和分泌的直接影响还不清楚。高胆固醇血症时，血管内皮细胞和平滑肌细胞的血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)受体Ⅰ的密度和亲和力增加[12]。而研究表明，血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂(ARB)具有独立于抗高血压，抗高血脂的抗AS的作用[13]。Strawn等的研究显示，在饮食诱导的高胆固醇血症动物模型中，给予Losartan治疗，还可减少动脉壁脂质条纹中源之巨噬细胞的泡沫细胞。但ARB的抗AS作用机制目前尚不明确。紧密连接是血管内皮细胞间的连接结构，呈带状围绕在细胞边缘，在各细胞间连接成网状，是调控细胞间大分子通透性的主要结构。动脉内膜下脂质沉着是AS形成初期的一个必经过程，其机制仍不清楚。在既往的AS危险因素与血管壁脂质沉着研究中，研究重点集中在高胆固醇血症对血管通透性的影响上，对机制的研究不多，同时也缺乏有关AS危险因素与内皮细胞紧密连接之间关系的分子生物学方面的研究。基于上述研究现状，本实验的目的有二：1．观察高胆固醇血症对血管内皮细胞VEGF合成和分泌的直接影响，探讨ARB的抗As作用机制。2．观察高胆固醇血症对内皮细胞紧密连接蛋白复合体的影响，探讨AS形成时动脉内膜下脂质沉积的机制。方法：1．建立永生化血管内皮细胞系原代人脐静脉血管内皮细胞购自上海Digestech公司，接种到Matrigel基质中，分别用含端粒酶逆转录酶(hTERT)和猿猴病毒40大T抗原(SV40LT)的重组逆转录病毒转染原代血管内皮细胞，用新霉素衍生物及嘌呤霉素进行筛选，培养建立筛选的细胞系。分别通过western blot检测转染的hTERT和SV40LT，光镜、扫描电镜形态学观察，免疫组织化学，ELISA和RT-PCR对建立的细胞系进行鉴定。2．观察内皮细胞的血管内皮生长因子(VEGF)表达的变化用含1％胆固醇的饲料喂养家兔，获得高胆固醇血清。在培养的血管内皮细胞中分别加入不同稀释度的高胆固醇血清，不同浓度的替米沙坦及磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)特异性抑制剂wortmannin，通过ELISA和western blot分别测定其VEGF的表达，测定PI3K活性。最后，采用体外血管生成试验进一步佐证其VEGF表达的改变。3．观察血管内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1的表达和分布的改变对培养的血管内皮细胞进行细胞爬片、固定，采用免疫荧光技术，观察ZO-1的分布；通过western blot和RT-PCR检测ZO-1的表达。通过血管渗透试验．观测血管内皮细胞通透性的变化。PI3K活性测定及PI3K特异性抑制剂wortmannin也被用于上述实验。结果：1．永生化血管内皮细胞系的建立用Ⅳ型胶原酶消化人脐静脉获得的血管内皮细胞呈扁平多边型，胞浆丰富，细胞核为圆形或椭圆型。细胞经转染含SV40LT和hTERT的重组逆转录病毒后8-12周，出现细胞克隆。细胞特性鉴定：扫描电镜观测可见细胞呈多边形或梭形，表面伸出很多绒毛状、指状突起，长短不一，相互连接；免疫组织化学检测呈Ⅷ因子阳性；ELISA显示内皮细胞特异性E-选择素为阳性；RT-PCR可检测到内皮细胞特异性脂肪酶mRNA：Western blot显示有SV40LT和hTERT阳性表达。对细胞端粒酶活性检测发现，其活性在12代时为0.36，第50代为0.38，而对照的原代血管内皮细胞其活性在第1代时为1.12，在第3代时为0.06。目前细胞已稳定传至60余代，未发现有恶性变倾向。2．内皮细胞VEGF表达的变化当高胆固醇血清的胆固醇浓度≥0.08mM／L时，培养的血管内皮细胞的VEGF表达明显增高，且与胆固醇浓度呈正相关；当同时加入wortmannin后，VEGF的表达被明显抑制，与正常对照组无差异；PI3K的活性与VEGF的表达呈正相关。替米沙坦对血管内皮细胞VEGF表达和PI3K活性有增高趋势，但与正常对照组无统计学差异；替米沙坦与高胆固醇血清合用，VEGF的表达和PI3K活性明显高于高胆固醇血清组，PI3K的活性与VEGF的表达呈正相关，PI3K的活性与VEGF的表达可被wortmannin明显抑制。高胆固醇血清可显著增强血管内皮细胞的体外血管生成，与替米沙坦合用则生成作用更为明显，替米沙坦单药的血管生成作用不明显。体外血管生成可被wortmannin明显抑制，与对照组无显著差异。3．紧密连接蛋白ZO-1的表达和分布变化高胆固醇血清组，其紧密连接蛋白ZO-1的表达与正常对照组无差异。正常对照组，ZO-1沿细胞边缘分布，镜下观测呈细线样网状结构；高胆固醇血清可使上述排布明显被打乱，细胞周边的网状结构发生断裂。高胆固醇血清组的上述ZO-1分布的改变可被wortmannin明显抑制。血管渗透实验显示，高胆固醇血清可显著增加血管内皮细胞对白蛋白的通透性，wortmannin则可明显抑制血管内皮细胞对白蛋白的通透性。结论：1．通过SV40LT和hTERT的共同异位表达，可有效实现血管内皮细胞生命周期的显著延长。2．高胆固醇血清可通过PI3K信息通路增加血管内皮细胞VEGF的表达。3．替米沙坦对血管内皮细胞VEGF的表达无影响。4．替米沙坦可促进高胆固醇血清所致的血管内皮细胞VEGF的高表达。5．高胆固醇血清对血管内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1的表达无明显作用；但可改变ZO-1在内皮细胞中的分布，增加内皮细胞的通透性；高胆固醇血清的上述作用，至少部分与VEGF的高表达有关。