研究背景创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)为神经外科中最为常见的疾病之一,通常是由直接或间接的对脑的机械破坏所引起,具有高致残率和高致死率。近几年的统计资料显示,随着城市化和工业化进程的不断加快,脑损伤的发生率也呈逐年上升趋势。尽管现代医疗技术的发展和医疗水平的提高使临床上颅脑损伤的诊治和相关的基础研究取得了突破性进展,但该病造成的患者死亡率和致残率依然居高不下。因此寻求行而有效的治疗TBI的手段极为重要。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)作为间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的一种,为一种多能干细胞,其自身具有极强的自我更新能力和分化潜能。因此BM-MSCs为干细胞移植治疗中枢神经系统损伤的理想种子细胞。BM-MSCs移植入宿主体内后能够继续存活并向神经细胞分化,分化后的神经元具有相应的生物学活性,从而能够替代死亡的神经元,同时BM-MSCs还能够迁移至中枢神经系统损伤区域,并在该处参与损伤修复过程,促进中枢神经系统功能的恢复、增强内源性细胞增殖、促进血管生成、减少病灶区域等。BM-MSCs移植已被证实能在包括创伤性脑损伤在内的中枢神经系统损伤的治疗中发挥有益作用。除此之外,还可以通过改造BM-MSCs以过表达其中有益于治疗的基因以增强BM-MSCs移植的疗效。BM-MSCs治疗已是TBI细胞治疗的热点之一,如何使BM-MSCs过表达对治疗有益的基因,以增强治疗效果更是TBI治疗的新兴方向,即以BM-MSCs作为有效的基因载体,用某种病毒等转染BM-MSCs,以使BM-MSCs能过表达有益治疗的基因,然后将转染后的BM-MSCs移植入脑内以达到加强TBI的治疗疗效。国内外已有学者把基因治疗与干细胞移植的治疗方法用于TBI模型动物中,并取得·定的可喜的成效。但口前尚无通过改造BM-MSCs过表达HIF-1α基因以增强TBI治疗效果的相关研究。大量研究表明,低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)在由缺氧所导致的细胞应答过程中发挥着重要作用。HIF-1α是一种转录因子,可以调节血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)的转录过程,同时对血管生成和神经再生均具有促进作用,同时有效调控糖酵解途径,促进红细胞生成,提高细胞的生存能力,最终发挥神经保护作用。VEGF是内皮细胞的促分裂原,能够具有通过与酪氨酸激酶受体识别并结合,进而发挥促进内皮细胞增殖、迁移和新血管形成的作用。有报道显示,VEGF还能够在体外和体内刺激神经元前体细胞增殖。还有研究发现,将外源性VEGF作用于创伤性脑损伤小鼠模型,能够显著增加脑室下区和周围皮质中增殖细胞的数量,同时还能在创伤性脑损伤后减小病变体积。EPO为生物机体中的一种与造血相关的生长因子,可以在组织细胞缺氧期间增加氧气的利用率。有研究证实,EPO在血管生成和神经发生中扮演重要角色。过去的研究发现,EPO治疗可以有效减少海马神经元的损伤,并以剂量依赖的方式增强创伤性脑损伤大鼠模型中受损皮层和海马的血管生成和神经再生。目前的研究已经证实,间充质干细胞移植对中枢神经系统损伤的治疗和功能的保护具有积极作用。同时,HIF-1α mRNA和蛋白的含量在发生创伤性脑损伤后也显著上调,提示HIF-1α对创伤性脑损伤后的神经具有保护作用,但MSCs与HIF-1α之间是否存在协同作用需进一步验证。在本实验中,我们首次选取BM-MSCs,非其他来源的MSCs,作为治疗的干细胞,通过腺病毒转染BM-MSCs并使其过表达HIF-Iα基因后移植入创伤性脑损伤小鼠模型,旨在探讨BM-MSCs对TBI模型小鼠的神经功能是否有修复作用以及过表达HIF-1α基因能否促进上述效应。研究目的本实验通过腺病毒转染BM-MSCs并使其过表达HIF-Iα基因后移植入创伤性脑损伤小鼠模型,探讨BM-MSCs对TBI模型小鼠的神经功能是否有修复作用以及过表达HIF-lα基因能否促进上述效应。1.探讨能否通过腺病毒转染的方法在BM-MSCs中过表达HIF-1α基因;2.探讨BM-MSCs能否作为TBI模型小鼠的种植细胞;3.探讨BM-MSCs移植入TBI模型小鼠后,TBI模型小鼠在各时期的行为学改变、神经再生及细胞增殖情况;4.探讨BM-MSCs移植入TBI模型小鼠后,TBI模型小鼠在各个时期脑组织病变体积、脑含水量变化及VEGF、EPO的mRNA和蛋白的表达情况;5.探讨过表达HIF-1α的BM-MSCs移植入TBI模型小鼠后,TBI模型小鼠在各时期的行为学改变、神经再生及细胞增殖情况;6.探讨过表达HIF-1α的BM-MSCs移植入TBI模型小鼠后,TBI模型小鼠在各个时期脑组织病变体积、脑含水量变化及VEGF、EPO的mRNA和蛋白的表达情况。实验动物与方法设计并构建含HIF-1α的腺病毒载体及相应对照载体,分别将之转染293细胞,收集细胞培养上清中的腺病毒并转染BM-MSCs,检测细胞中HIF-1α mRNA和蛋白的表达,以证实HIF-1α过表达的BM-MSCs构建成功。我们用体重相近的若干只BALB/c小鼠(6-8周龄)作为实验动物,采用脑皮质撞击法建立创伤性脑损伤小鼠模型(中度脑损伤),小鼠完全清醒后通过神经功能缺损评分(Modified neurologicαl severity score,mNSS)(附图表 1)评估各组小鼠的神经系统功能;评分为7-12分为中度脑损伤,并表示建模成功;在模型建立6h后经尾静脉注入HIF-1α过表达的BM-MSCs,同时设空白对照组、注射生理盐水的对照组、注射BM-MSCs组,在第1、3、7、10、14天时检测小鼠神经功能缺损评分。在TBI建立后第7天时处死小鼠,检测大脑含水量和病变体积。分别采用BrdU和和BrdU/NeuN进行免疫荧光染色,检测小鼠脑组织中BrdU-L和BrdU/NeuN+细胞数量,明确HIF-1α过表达的BM-MSCs对TBI后细胞增殖和神经再生的影响。检测各组小鼠脑组织中VEGF、EPO mRNA和蛋白的表达情况。本研究所有的统计分析均使用SPSS22.0软件进行。数据结果表示为平均值±标准差(x±s)。采用卡方检验进行两组之间的比较,并使用Tukey检验的事后对比的单因素方差分析来比较多组的参数。P<0.05被认为有显著统计学差异。研究结果1.HIF-1α在BM-MSCs中的过表达情况我们把HIF-1α转染入BM-MSCs后,用RT-PCR和蛋白质免疫印迹试验分别检测各组的HIF-1α mRNA和蛋白表达的情况,结果如图1、2所示。图1显示,Ad.HIF-1α组的HIF-1α mRNA明显高于对照组和Ad.null组。图2显示Ad.HIF-1α组的HIF-1α蛋白的表达量是最高的,蛋白定量分析进一步显示,Ad.HIF-1α组的HIF-1α蛋白含量是对照组和Ad.null组的3.5倍左右。这些结果证实,HIF-1α成功转染到BM-MSCs中,并导致HIF-1α蛋白水平升高。即HIF-1α过表达的BM-MSCs构建成功。2.TBI小鼠移植治疗后神经功能及脑损伤的改变TBI模型小鼠体内被注射入过表达HIF-1α的BM-MSCs,然后通过mNSS评分评估其神经功能变化。在移植后的1,3,7,10,14天评估TBI模型小鼠的mNSS评分。在四组(空白对照组、Vehicle、MSC组和HIF-1α MSC组)的对照中,我们发现过表达HIF-1α的HIF-1α MSC组的TBI模型小鼠的mNSS评分改善最明显,提示神经功能的恢复程度最大,其次是MSC组(如图3所示),而HIF-1α MSC组与MSC组的mNSS评分也出现显著性差异。这些结果显示,BM-MSCs可改善TBI模型小鼠的神经功能,而过表达的HIF-1α可促进这一效应。各组小鼠处死后取脑,分别测量脑损伤体积及大脑含水量。在四组中,Vehicle组的病变体积及含水量均为最大,MSC组和HIF-1α MSC组依次下降,并且损伤脑组织体积与损伤脑组织含水量呈同步性(图4、5)。实验结果提示:BM-MSCs移植能起到减小脑损伤体积、减轻脑水肿等保护脑组织的功能,而HIF-1α在BM-MSCs中的过表达可增强BM-MSCs对TBI诱导的脑损伤的保护作用。3.TBI小鼠移植治疗后神经发生及细胞增殖的变化TBI主要导致脑细胞缺失及神经坏死。在TBI小鼠移植治疗7天后,对脑组织进行染色,来评估移植的BM-MSCs对神经元及神经细胞增殖产生的影响。为了分析血管生成,在损伤边界区和齿状回中计数BrdU+细胞。为了分析神经再生,我们计算齿状回及其子区域中的BrdU+细胞和NeuN/BrdU+共标记细胞。阳性细胞的定量显示,MSC组有更多的阳性细胞,几乎是Vehicle组中的2倍(如图6所示)。同时,HIF-1α MSC组与MSC组相比,阳性细胞数量也存在显著性差异(如图7所示)。这些结果提示BM-MSCs移植能引起损伤区神经元及神经细胞增殖相关的阳性细胞的增多,而此种效应在HIF-1 α MSC组中最为明显,意味着过表达HIF-1α能够促进TBI模型小鼠神经元的再生及神经细胞的增殖。4.TBI小鼠移植治疗后VEGF、EPO mRNA和蛋白表达水平的改变部分实验指出,BM-MSCs通过促进血管生成、改善损伤区域微循环而起到促进神经功能恢复的作用,为验证BM-MSCs是否具有促进血管生成等作用,我们通过RT-PCR及蛋白质免疫印迹试验检测VEGF、EPO的mRNA和蛋白的表达水平。结果显示:与Vehicle组相比,MSC组与HIF-1α MSC组的VEGF、EPO mRNA和蛋白的表达水平显著增高(P<0.05),而HIF-1α MSC组的差异性更明显(如图8、9所示)。因此,HIF-1α过表达能够加增强BM-MSC对VEGF和EPO表达的诱导功能。研究结论1.BM-MSCs移植入TBI小鼠脑内后,mNSS评分下降,细胞增殖及神经再生增多,提示其可作为TBI模型小鼠的种植细胞并能起到修复神经作用。2.BM-MSCs移植入TBI小鼠脑内后,TBI模型小鼠脑组织的病变体积和脑含水量降低,同时,同侧皮质中VEGF、EPO mRNA和蛋白的表达水平增高,提示BM-MSCs移植后通过刺激血管生成和神经再生降低脑损伤程度。3.HIF-1α过表达的BM-MSCs移植入TBI模型小鼠脑内后,mNSS评分进一步下降,细胞增殖及神经再生继续增多,小鼠脑组织的病变体积和脑含水量下降及VEGF、EPO mRNA和蛋白的表达水平的增高较BM-MSCs明显,证明HIF-1α可以在BM-MSCs中过表达,并且HIF-1α基因修饰的BM-MSCs具有更高的增殖活力,能够显著提高BM-MSCs的治疗效果。4.HIF-1α过表达的BM-MSCs移植可作为一种新的治疗创伤性脑损伤的方法,也可作为缺血缺氧性脑病的细胞、基因联合治疗的科研基础。同时,提示我们可以通过病毒感染等方法人为上调MSCs中有益于治疗的基因,以达到提高治疗效果的目的。