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胰岛素发挥生物学功能依赖于胰岛素信号通路中各级信号转导分子的级联激活,其中任何信号分子的抑制或降解,均会导致信号转导中断,引起机体出现代谢紊乱等胰岛素抵抗现象。细胞中大多数蛋白质的降解依赖于泛素蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system,UPS）,其中底物泛素化过程的特异性取决于E3泛素连接酶。Itch是一种高度保守的HECT家族E3泛素连接酶,在生理情况下,Itch与底物蛋白特异结合,催化底物蛋白的泛素化并经蛋白酶体降解,参与底物介导的免疫调控、细胞周期等多种生物学过程。研究证实,胰岛素抵抗与UPS相关,但是,关于Itch如何参与胰岛素抵抗的发生尚不清楚。课题组前期研究结果显示,在人肝癌Hep G2细胞胰岛素抵抗状态下,Itch基因在翻译水平表达上调。为了进一步研究Itch如何影响人肝癌Hep G2细胞内胰岛素的敏感性,本实验构建了Itch基因抑制和过表达两种模型。通过脂质体介导,将Itch特异性的小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）及重组质粒p En CMV-Itch-3×Flag分别转染到Hep G2细胞,经实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,q RT-PCR）技术筛选确定了最佳转染条件和对Itch基因抑制效果最佳的si RNA。基于Hep G2细胞成功构建Itch基因抑制和过表达模型后,我们首先检测了Itch基因抑制和过表达对Hep G2细胞葡萄糖利用率的影响。结果发现,si RNA抑制Itch基因表达时,Hep G2细胞的葡萄糖摄取增加,比正常对照组上调了约10%（P<0.05）;而重组质粒介导的Itch基因表达升高时,细胞对葡萄糖的摄取减低,比正常对照组下调了约20%（P<0.05）。这说明E3泛素连接酶Itch的表达负向调控Hep G2细胞对葡萄糖的利用率,进一步地,抑制Itch基因的表达可提高Hep G2细胞对胰岛素的敏感性。在胰岛素信号通路中,信号分子的级联转导决定着胰岛素的功能发挥,信号转导阻断将导致胰岛素抵抗的发生。因此,我们进一步探究了Itch对胰岛素信号通路中关键信号分子胰岛素受体-β亚基（insulin receptor-βsubunit,IR-β）、胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate 1,IRS1）和蛋白激酶B（protein kinase B,PKB/Akt）表达的影响。基于构建成功的Itch基因抑制和过表达模型,采用Western blot技术检测了细胞内IR-β、IRS1和Akt蛋白水平以及它们的磷酸化蛋白水平。结果显示,与正常对照组相比,Itch蛋白表达抑制时,细胞内的IR-β、IRS1蛋白表达升高（P<0.05）,胰岛素诱导的IR-β酪氨酸磷酸化水平增加,IRS1丝氨酸307位点的磷酸化水平降低;细胞内Akt蛋白水平变化无显著性差异（P>0.05）,但Akt蛋白丝氨酸473位点的磷酸化水平增高（P<0.05）。那么在Itch基因抑制状态下,IR-β蛋白的酪氨酸磷酸化水平和Akt蛋白丝氨酸的磷酸化水平的增高,以及IRS1蛋白的丝氨酸磷酸化水平的降低,提示细胞的胰岛素信号转导增强。这说明抑制Itch基因,可能能够预防或改善肝细胞胰岛素抵抗的发生。相反,Itch蛋白表达升高时,细胞内IR-β和IRS1蛋白表达降低（P<0.05）,胰岛素诱导的IR-β酪氨酸磷酸化水平显著降低,同时IRS1丝氨酸307位点的磷酸化水平升高（P<0.05）,Akt蛋白丝氨酸473位点的磷酸化水平降低（P<0.05）。那么在Itch基因过表达状态下,IR-β蛋白的酪氨酸磷酸化水平和Akt蛋白的丝氨酸磷酸化水平的降低,同时IRS1蛋白的丝氨酸磷酸化水平的升高,说明胰岛素信号通路转导受到抑制,可能促进肝细胞胰岛素抵抗的发生。这提示Itch蛋白表达负向影响着胰岛素通路的信号转导。由于Itch属于E3泛素连接酶的家族成员,其功能发挥依赖于其WW结构域与底物结合而将其泛素化降解。为探讨Itch是否靶向降解胰岛素通路关键蛋白,从而影响胰岛素信号的正常转导。我们应用免疫共沉淀技术,检测Itch蛋白是否与IR-β和IRS1存在相互作用,结果证实,Itch蛋白能在细胞内源水平上与IR-β和IRS1蛋白相互作用。前已述及,Itch蛋白的表达与IR-β和IRS1蛋白表达呈负相关,据此推测,Itch在高表达状态下,与IR-β和IRS1相互作用而结合,进而促进了它们的泛素化降解。综上,我们的研究进一步证实了Itch与胰岛素抵抗密切相关,Itch基因的表达水平影响Hep G2细胞对胰岛素的敏感性;Itch调控胰岛素信号通路关键蛋白IR-β和IRS1的表达,以及IR-β、IRS1和Akt蛋白的磷酸化水平,它的过表达趋于促进胰岛素抵抗的发生;在细胞内源水平上,检测到Itch蛋白与IR-β和IRS1蛋白存在相互作用,推测Itch可能通过靶向结合IR-β和IRS1蛋白,介导其泛素化降解而参与调节肝细胞的胰岛素通路信号转导。