芡实系睡莲科植物芡(Euryale ferox Salisb)的干燥成熟种仁。始载于《神农本草经》,列为上品。主产地为江苏、山东、湖南、湖北、安徽等省。主要有两个栽培种,即“剌芡”与“苏芡”。具有益肾固精,补脾止泻,祛湿止带的功效,是临床常用中药。本课题依托“国家十二五科技支撑计划”项目“芡实中药材质量标准提高及其综合利用研究”,以传统中医药理论为指导,研究芡实这一大宗水生植物药材品质评价标准的提升,探讨非传统药用部位的特性,以期实现芡实资源的综合利用。本文主要研究内容有:1芡实文献的研究。考证芡实的来源并分类、对芡实的营养与功效物质、药理与临床功效、药材质量评价方法、栽培技术、开发利用与资源保护等进行了系统整理,并对水环境对水生药材品质影响进行了文献研究,为芡实等水生植物药材研究提供新思路。2进一步开展了芡实生产和资源调查研究。本课题组前期资源调查的结果表明,国内芡实种植地主要集中在江苏、山东、广东、湖北等省。江苏省的芡实种植具有较大规模,位于太湖流域的苏州是南芡(苏芡)的道地产区。目前苏州淞泽园水生蔬菜基地、苏州娄葑镇群力村、苏州蔬菜研究所、苏州东太湖等都是有特色的芡实生产基地。但由于受城市化进程加快和水体环境恶化的影响,苏芡的产量和质量也都受到了一定影响。近年价格水涨船高,2011年鲜米160元/kg,干货270元/kg。因此,扩大芡栽培面积,增加产量,提升质量是芡实资源生产要解决的重要问题。3通过化学成分系统预试验,明确了芡实种仁含有氨基酸、蛋白质、糖、酚类、有机酸等大类成分,并深入探讨了水溶性成分。以15个产地芡实为原料,采用氨基酸自动分析仪检测,对其进行组成分析和营养评价。芡实中总氨基酸平均值为103.33mg/g,游离氨基酸为0.98mg/g。第一限制氨基酸为赖氨酸,比值系数分SRC为66.98%。Glu、Leu是芡实氨基酸的主成分,产地差异明显。各产地水溶性蛋白质含量均较低,平均值为0.4577mg/g。芡实水溶性蛋白质含量有明显的产地差异,长江流域含量较高,南方芡实次之,而北方芡实的水溶性蛋白质含量最少。采取水提醇沉法提取芡实多糖,Sevage法除蛋白,通过改良苯酚—硫酸法测定多糖含量,考马斯亮蓝法测定多糖中蛋白质含量。实验表明,芡实粗多糖纯度为73.25%,而精多糖达到了 76.22%。采用Sevage法除蛋白前后,芡实粗多糖和精多糖中蛋白质含量从6.27%减少到1.39%,表明Sevage法在一定程度上有良好的去蛋白效果,值得推广。DEAE-52纤维素分离得到 EPJ-A1、EPJ-B1、EPJ-B2、EPJ-B3、EPJ-B4、EPJ-C1、EPJ-D1、EPJ-D2、EPJ-D3为等级分。Sephadex G-100凝胶柱分离得到两个组分,EPJ-A1-1和EPJ-A1-2。理化鉴别表明,各级分大多不含糖类以外的成分,水溶性较好,颜色基本为白色或黄色。HPLC-ELSD法测定芡实多糖各级分纯度显示,DEAE-52分离的级分均不纯,水部位EPJ-A1经Sephadex G-100后得到的两个级分EPJ-A1-1、EPJ-A1-2基本已为均一分子量多糖,肯定了两次柱分离达到了较好的效果。芡实多糖分子量分布较为集中,90%均在15 kDa以下。芡实多糖单糖组成较简单,仅为葡萄糖和鼠李糖,其中大部分为葡萄糖,也可以推测芡实多糖是由多个葡萄糖苷键组成的复杂多糖。MTT试验结果证实,芡实多糖几乎无细胞毒性,可以作为食品、药品、保健品研究的原料。针对芡种皮中大量的单宁成分,可制成有经济价值的栲胶用于工业。通过响应曲面法优化得到芡实种皮多酚的超声提取工艺条件为:丙酮浓度57%、液料比57mL/g、超声时间23min。并通过D101大孔树脂富集,得到水、10%乙醇这两个部位为纯化栲胶。按照《中华人民共和国林业行业标准》LY/T 1083-2008、LY/T 1082-2008的分析试验方法,证实芡实种皮符合栲胶原料标准,且其制成的栲胶大部分指标与现行其他主要栲胶要求相符。但颜色较深需要脱色,沉淀量过大需要进一步精制,方可提高使用范围。4芡实指纹图谱的建立,从“全成分”的角度出发,对提高芡实质量标准有重要意义。建立了芡实高效液相色谱指纹图谱,确立了 17个共有峰。以各产地间峰面积相对百分含量初步拟订特征指纹峰,均以1、3、4、5、13号峰为强峰。共有峰的相对保留时间符合程度较好,但相对峰面积差别较大。以共有模式图谱为对照,各产地样品相似度在0.633～0.981之间,以对照药材为参照,相似度在0.654～0.998之间,说明不同来源的芡实饮片质量波动较大,建立标准指纹图谱时相似度应不低于0.9。HPLC指纹图谱是常用品质评价工具,具有全面性。柚皮素含量较低,仅为1.9539±0.0143μg/g,且发现不同产地间柚皮素含量差异明显。除柚皮素外,其他特征峰的鉴别有待于进一步深入研究。红外光谱采用双指标序列分析法比较了 17个产地芡实药材的相似度,依据共有峰率和变异峰率大小分为了 A、B、C、D四类。产地相近样品之间有很高的共有峰率(均超过82.4%)和很低的变异峰率(均不超过21.4%);产地不同但品种一致的样品之间有不高的共有峰率(均不超过52.4%)和不低的变异峰率(均大于33.3%);地理位置相距较远的样品之间有较低的共有峰率(均低于47.6%)和较高的变异峰率(均超过50.0%);产地不同且采收期较近,造成了 S10与其他产地相比有着极低的共有峰率(均不超过35.7%)和极高的变异峰率(几乎都高于100%)。各产地近红外图谱波形和吸光度大小有很大的相似性,表明芡实药材质量总体平稳,变异趋势较小。当选取指纹区的波长范围为1196-2332nm时,特征峰较为明显,能建立芡实近红外光谱预测模型。确定了 8个共有吸收峰,峰位2331.017nm、2313.353nm、2101.412nm、1928.765nm、1761.000nm、1549.000nm、1468.118nm、1196.000nm,主成分峰位分别为 1549.000nm、1468.118nm、1761.000nm。5课题组前期筛选出疗效较好的多糖部位以及废弃物种皮中大量含有的多酚鞣质类物质两个部位作为抗衰老作用研究的对象。抗疲劳耐缺氧试验结果表明,与VC、VE组相比,各剂量多糖组和种皮多酚组小鼠负重游泳时间和常压密闭耐缺氧时间均延长,显著提高了小鼠的抗应激能力,且量效关系明显。其活动能力、食量、精神状态、日均体重增加量、脏器系数明显优于空白对照组和阳性药物组,增加小鼠肝糖原、肌糖原、降低血清BUN、提高小鼠血清LDH、增加组织和血清中NO含量,均证实芡实多糖及其种皮多酚确实具有延缓衰老的作用。芡实多糖和种皮多酚对D-半乳糖致小鼠衰老模型,能提高组织和血清中SOD、CAT、GSH-Px、Hyp活性,降低MAO活性,阻断脂质过氧化过程,减少MDA的生成,从而有效地清除ROS。同时能够缓解造模所致衰老小鼠的胸腺和脾脏等免疫器官指数下降。芡实多糖和种皮多酚是潜在的抗氧化剂,提取方便,具有广阔的开发前景。体外抗氧化试验证实,芡实多糖、种皮多酚能有效清除·OH、O2-·等自由基,对亚硝胺合成以及亚硝基清除有一定作用,对DPPH·及其灵敏,对含脂食品的自动氧化防止有一定帮助,还原力大于同浓度下阳性药VC和TBHQ,提示其能够治疗因氧自由基损伤所引起的疾病。6考察环境因子对有效成分的积累变化,筛选出最重要的影响指标,通过灰色关联度模型,比较各产地芡实质量优劣。两者从外因和内因协同判定药材品质,构建了芡实质量评价综合体系。气温、日照时数、平均风速分别是影响柚皮素、总氨基酸、水溶性蛋白质含量的主导环境因子。灰色关联度判定广东肇庆芡实以其高相对关联度0.657,成为品质最佳的产地。