黄瓜枯萎病(Cucumber Fusarium Wilt)是黄瓜生产上严重的土传真菌病害。这种土传真菌能够在各种不同类型的土壤中存活并导致植株发病，病害一旦发生，往往会给黄瓜的质量与产量造成严重的损失。黄瓜枯萎病菌是尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)。关于尖孢镰刀菌的致病机理方面已有很多报道，主要包括导管堵塞假说、毒素作用假说、细胞壁降解等。但是由于对病原菌生物学特性认知的局限性，目前的研究还没有完全阐明黄瓜枯萎病菌的致病机理，因此对黄瓜枯萎病的防治仍然没有非常行之有效的措施。　　生物膜(biofilm)是微生物聚集在一起，附着在生物或者非生物的表面，并包埋在自身分泌的胞外物质里，与浮游状态相对的一种存在形式。生物膜的形成是人体、动物病原菌致病的关键因素。受人体角膜炎病原菌（Fusarium oxysporum）能够形成生物膜并参与致病的启发，本研究探索黄瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.cucumerinum)Foc-GD生物膜的形成与致病性的关系。主要开展生物膜形成条件的摸索、生物膜特性的分析、生物膜调控基因的挖掘及功能验证等方面的研究。主要取得以下结果:　　1、黄瓜枯萎病菌Foc-GD生物膜的形成方法及条件。研究发现，用RPMI1640培养基重悬黄瓜枯萎病菌Foc-GD孢子至106 cfu/mL，将200μL标准的孢子悬浮液添加至平底96孔聚苯乙烯细胞培养板的每孔内，将细胞培养板置于28℃培养箱内静置培养2h,用微量洗涤器将培养基及没有黏附到培养板的孢子轻轻吸取，用PBS轻柔地漂洗两次，最后粘附在细胞培养板表面的是生物膜的初始菌落，然后添加200μL RPMI1640培养基于细胞培养板每个孔内继续静置培养48h，至生物膜成熟。采用XTT(3，3-[1-(苯氨酰基)-3，4-四氮唑]-二（4-甲氧基-6-硝基）苯磺酸钠）减低法对生物膜进行半定量测定。结果显示，黄瓜枯萎病菌生物膜形成与培养基pH值、碳源和培养温度有关。生物膜形成最适温度是28℃，最适pH环境为微酸和中性环境(pH5～7)，葡萄糖为碳源的培养基中能够形成生物膜。　　2、病原菌Foc-GD生物膜特性分析。黄瓜枯萎病菌形成的生物膜用荧光染料染色后，借助激光共聚焦显微镜观察生物膜微观结构。研究发现Foc-GD形成的成熟生物膜由浓密的菌丝细胞和胞外多糖分泌物组成，菌丝细胞与胞外多糖物质紧密排列，形成质地均一的复合体。　　成熟生物膜与浮游孢子相比，表现出对外界环境压力不敏感型。研究发现，在45℃的亚致死温度下，处理30 min和min，成熟生物膜的代谢活动无明显影响，而浮游孢子代谢活动分别降低了62.25％和86.29％。成熟生物膜与浮游孢子在-20℃，-10℃，4℃下处理24h，浮游孢子与成熟生物膜在4℃下代谢活动没有明显差异，而-20℃，-10℃的低温对成熟生物膜的影响明显小于对浮游孢子的影响。样品在紫外线下处理20min，30min后，成熟生物膜分别下降了29.18％、43.11％，而浮游孢子却下降了52.29％、90.23％。用6.4μg/mL的多菌灵、咪酰胺、丙环唑分别处理样品24h之后，成熟生物膜的代谢活动分别下降了33.8％、39.2％和26.6％，而浮游孢子分别下降了76.5％、73.2％、50.7％。　　3、病原菌Foc-GD丝绒蛋白基因FocVel1的克隆与表达。研究表明，丝绒蛋白FocVel1(GenBank: KJ716229)编码532个氨基酸，最大开放阅读框为1596bp,含有1个94bp的内含子。将FocVel1氨基酸序列比对，分别与Ffujikuroi的FfVel1(GenBank:FN548142),F.verticillioides的FvVe1(GenBank:DQ274059),F graminearum的FgVEAfrom(GenBank: JN635273)具有97.56％，97.74％，78.29％的相似性。　　借助实时荧光定量PCR分析Foc Vel1在野生型Foc-GD菌丝发育的24，36，48，60，72h表达情况。FocVel1在菌丝发育的24和36h，表达量较低(p＜0.05）;在48h，达到高峰，在60和72h，表达量相对降低并稳定保持较高水平(P＜0.05）。Foc Vel1的表达结果与文献报道黄瓜枯萎病菌分生孢子梗在48h之后增殖的结果是一致的。　　4、黄瓜枯萎病原菌丝绒蛋白基因Foc Vel1的功能验证。利用基因敲除与回补的方法研究Foc Vel1的功能。研究发现，丝绒蛋白Foc Vel1基因具有调控病原菌孢子发育、菌丝生长、细胞壁组分、生物膜形成与致病性的作用。用马铃薯葡萄糖(PDA)培养基培养菌株，Foc Vel1敲除突变体⊿Foc Vel1-3产孢量远远小于野生型菌株Foc-GD和回补突变体⊿FocVel1-3C(p＜0.05)，⊿Foc Vel1-3菌落生长明显变慢，气生菌丝变少变短，并且菌丝分支明显增多。分别用1.0 M KCl、1.0 M山梨醇、16μg/mL异菌脲、0.2μg/mL咪鲜胺、48μg/mL恶霉灵、0.05％刚果红、5 mM咖啡碱添加至培养基，研究菌落对渗透压力与细胞破坏剂的敏感性。研究发现，⊿Foc Vel1-3对1.0 M KCl、1.0M山梨醇、0.05％刚果红、5 mM咖啡碱的敏感性下降(p＜0.05)，对16μg/mL异菌脲、0.2μg/mL咪鲜胺的敏感性上升(p＜0.05），结果表明Focvel1可能与细胞壁的组成、细胞壁的完整性有关。　　生物膜形成比较发现，在聚苯乙烯片上，突变体⊿FocVel1-3孢子在聚苯乙烯板上的聚集减少，而且孢子萌发和菌丝的生长延迟，⊿FocVel1-3形成的生物膜比较稀薄，比较松散，菌丝与胞外物质分布不均。XTT半定量法测定显示野生型Foc-GD和回补型菌株⊿FocVel1-3C成膜的量分别是基因敲除突变菌株⊿FocVel1-3的1.23，1.52，1.69，2.56倍。　　用突变体⊿FocVel1-3与野生型Foc-GD、回补型⊿FocVel1-3C接种黄瓜苗，15天后，接种野生型Foc-GD和回补型⊿FocVel1-3C的黄瓜苗逐渐发病并枯萎死亡，病情指数DSI分别为93.7和92.3，而接种FocVell基因敲除突变菌株⊿FocVel1-3的黄瓜苗发病率明显下降，多数黄瓜苗只出现轻微黄化症状，病情指数DSI为37.3(p＜0.05)。结果表明FocVel1基因与黄瓜枯萎病菌Foxysporumf.sp.cucumerinum生物膜形成及致病力有关。　　5、黄瓜枯萎病菌转化GFP载体。借助激光共聚焦显微镜观察到在接种病原菌孢子悬浮液24h后，孢子不断萌发并粘附到黄瓜苗侧根的表面，随着接种时间的延长，病原菌逐渐刺穿侧根表皮，进入表皮细胞。侵染进展期，病原菌侵入主根表皮，并不断向维管束部分侵染，接种120h之后，即侵染后期，病原菌占据主根维管束部位，菌丝逐渐密集成交错菌丝网。　　本研究中黄瓜枯萎病菌Foc-GD FocVel1基因敲除后，生物膜的形成受损，致病力下降，表明生物膜的形成是植物病原真菌重要的致病因子，该研究结果为揭示黄瓜枯萎病的致病机理提供新思路，对黄瓜枯萎病的综合防控提供理论支持。