泛素化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,是指单个或多个泛素分子连接到目标蛋白赖氨酸(Lys)残基上的修饰过程,需要E1泛素激活酶、E2泛素结合酶以及E3泛素连接酶的共同参与。在细胞生命过程中起着重要调控作用,涉及细胞周期、细胞凋亡、DNA损伤修复、蛋白相互作用以及信号转导等方面。干扰素(IFN)是宿主抗病毒感染的重要防御机制,也是当前抗病毒天然免疫研究的重点。I型干扰素表达异常会引发相关的免疫疾病,因此严格调控I型干扰素对于维持机体的免疫稳态十分重要。泛素化作为一种热门并且关键的翻译后修饰,在干扰素产生及其信号转导中扮演着关键角色。泛素特异性蛋白酶(USPs)是家族成员数目最多的去泛素化酶(DUBs),正受到广泛的关注,其功能和结构因家族成员众多而存在多样性。本实验以USP15作为研究对象,深入探究其在调节I型干扰素信号通路中的作用,为扩充USPs家族的生物学功能提供理论基础。泛素化修饰不仅调节细胞内多项生理功能,还参与调控多种病毒的复制与增殖过程,如牛病毒性腹泻病毒基因组有泛素和类泛素基因;轮状病毒等利用泛素蛋白酶体途径调节自身复制;人免疫缺陷病毒等编码蛋白可以发生泛素化修饰;流感病毒等通过编码具有E3泛素连接酶活性的蛋白或者其他途径调控细胞内蛋白的泛素化修饰。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是危害当前养猪业的重要病原,其免疫机制十分复杂。目前关于泛素化修饰在PRRSV感染与免疫中的作用尚不清楚。因此本研究利用蛋白质组学技术对PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)前后泛素化修饰进行了定量分析,揭示泛素化修饰在PRRSV感染与致病性方面发挥的重要作用。具体研究内容如下:1.泛素特异性蛋白酶USP15调控I型干扰素的机制研究在我们前期通过siRNA筛选调控干扰素的泛素特异性蛋白酶时,发现干扰USP15后可以上调ISRE启动子活性,因此对其进行进一步研究。干扰分子干扰内源性USP15基因后仙台病毒诱导的IFN-β表达(启动子水平,mRNA水平以及蛋白水平)、IRF3和NF-κB启动子活性及磷酸化修饰、ISRE启动子活性及干扰素刺激基因(ISGs)的表达都有明显上调,而在细胞内超表达USP15后则呈现显著的抑制效果。此外,我们还通过观察对干扰素高度敏感的水泡性口膜炎病毒(VSV-GFP)的增殖情况,证实超表达USP15可以显著抑制干扰素的产生。进一步的体外及体内去泛素实验证实USP15具有去泛素活性且活性位点是第269位C(半胱氨酸)及862位H(组氨酸)。免疫共沉淀实验发现,USP15可以特异性去除RIG-I K63形式偶联的多聚泛素。通过分析USP15的突变体,发现USP15 DUB活性位点突变后其抑制IFN-β活性的能力显著降低但并未完全丧失,表明USP15抑制干扰素产生需要但不完全依赖其DUB活性。同时,我们还发现USP15可以与RIG-I直接相互作用,并且竞争性抑制RIG-I对IPS-1的募集,而且DUB活性位点突变的USP15突变体同样可以通过与RIG-I发生相互作用进而减弱RIG-I与IPS-1之间的结合,进一步证实USP15可以通过不依赖去泛素化活性的方式抑制干扰素产生。因此,USP15可以通过两种不同的机制抑制干扰素产生及其信号通路:(1)USP15特异性去除RIG-I K63形式连接的多聚泛素;(2)USP15竞争性抑制RIG-I对IPS-1的募集作用。2.PRRSV感染细胞的泛素化蛋白质组学将PRRSV WUH3株感染猪原代肺泡巨噬细胞,于感染后36 h收集被感染细胞,利用Label-free技术,结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS),对PRRSV感染细胞泛素化修饰的变化情况进行检测和分析。共鉴定出315个蛋白的431个泛素化位点修饰显著上调,402个蛋白的552个泛素化位点修饰显著下调。通过生物信息学技术对修饰存在显著差异蛋白的亚细胞定位、生物学功能、KEGG代谢通路等进行分析,发现修饰显著差异蛋白与蛋白酶体降解、蛋白定位以及能量代谢等多种生物进程相关,并且发生泛素化修饰的motif有3种,分别为:Kub XXP、RXXXXLXKub和KubQ。将PRRSV WUH3株感染PAM细胞后的差异蛋白质组学与泛素化修饰组学进行关联分析,证实泛素化修饰与蛋白表达量之间没有明显的关联。通过对修饰存在显著差异蛋白的生物学功能进行深入分析,发现许多蛋白与干扰素信号通路、NF-κB信号通路相关,如TRAF6、IL-1β、HMGB1、JAK1、Mx2以及ISG15等,表明泛素化修饰的改变在PRRSV调控干扰素及炎症反应中起到了关键作用。同时,我们还发现PRRSV编码的15种蛋白(nsp1β、nsp2、nsp3、nsp4、nsp7、nsp8、nsp9、nsp10、nsp11、nsp12、ORF2a、ORF3、ORF5、ORF6、ORF7)的64个位点存在泛素化修饰,包括参与RNA合成、诱导中和抗体产生以及决定病毒感染力的非结构蛋白与结构蛋白,而且我们还发现泛素蛋白酶体途径抑制剂处理PAM细胞后PRRSV的增殖受到明显抑制,提示泛素化修饰可能在PRRSV的转录、复制以及蛋白合成中发挥作用。