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犬流感是由犬流感病毒（canineinfluenza virus,CIV）引起的犬只流涕、咳嗽、发热,引发支气管炎、肺炎,甚至造成死亡的一种病毒性疾病。自然条件下,多种来源的流感病毒均可感染犬,且易发生病毒基因的重组。H3N2是流行在亚洲地区的犬流感病毒主要亚型,该亚型还可感染猫。作为伴侣动物,犬还可能作为流感病毒（如季节性H1N1）的中间宿主,对人类健康产生巨大的威胁。因此,犬流感的防控具有重要的公共卫生意义。目前,治疗性抗体中研究比较多的单克隆抗体由于具有异源性,给临床应用带来了一定的限制,因此,完全犬源化抗体是个理想选择。1从外周血淋巴细胞中制备抗H3N2亚型犬流感病毒重组犬源化抗体为了制备完全犬源化的重组抗体,采集CIV感染犬外周血淋巴细胞提取总RNA,利用PCR技术扩增IgG重链（VH）、轻链（VL）和抗体恒定区（Fc）片段。利用重叠延伸PCR（SOE-PCR）将VH和VL通过弹性肽链Linker连接成单链抗体（single chainantibodyfragment,scFv）片段,并转化大肠杆菌,挑取阳性菌测序。经分析筛选后,将目标scFv与Fc片段链接,构建scFv-Fc重组犬源抗体片段。经诱导表达,获得分子量约为50 kD的scFv和约为89 kD的重组抗体scFv-Fc。抗体活性测定结果表明,scFv、scFv-Fc均能与CIV特异性结合,1 mg/mL scFv的ELISA效价为1:210,血凝抑制（HI）效价为1:27,中和抗体效价为1:20。1 mg/mL scFv-Fc的HI效价为1:26,ELISA效价1:25,中和抗体效价为1:20。2利用噬菌体淘筛技术制备抗H3N2犬流感病毒重组犬源化抗体为制备较高中和活性的重组犬源化抗体,利用pCANTAB 5E噬菌体展示系统,经过四轮生物淘筛,获得库容为8.4×105 CFU/mL的噬菌体抗体库,经phage-ELISA检测,获得的抗体库阳性率在86%以上,其中19株抗体的phage-ELISA检测值较高,P/N值均大于4。将这19株阳性抗体菌株在宿主菌HB2151中进行小量预表达,经抗E-tag标签ELISA检测,筛选出其中检测值较高的6株菌株,将其与获得的犬源Fc片段进行重组,成功4株。经验证,这4株重组犬源抗体均具有较高的ELISA效价,为1:211,其中两株（166-Fc和150-Fc）具有1:160的微量细胞中和活性效价。3抗H3N2犬流感病毒重组犬源化抗体动物保护性分析为研究抗犬流感重组抗体在动物体内是否有保护性,以166号重组抗体和06病毒为试验材料,在BALB/c小鼠和比格犬体内评价其保护性。小鼠试验设置病毒组、阴性对照组（PBS）、抗体预防组、抗体治疗组,后2组分别在滴鼻攻毒前24h和攻毒后24h,腹腔注射最大保护剂量20mg/kg的抗体,对不同时期小鼠的相关指征（体温、体重、肺脏中相关细胞因子及器官病毒载量等）进行测定。病毒组攻毒后第2天体重开始减轻,至第4天降到最低,其肺脏和粪便病毒载量均在攻毒第2天出现升高,至第6天达到最高,整个感染过程中明显高于抗体预防组和抗体治疗组（P<0.001）,抗体预防组与抗体治疗组病毒载量没有差异性;肺脏细胞因子白细胞介素6（IL-6）、II型肺泡表面抗原（KL-6）、γ干扰素（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）表达结果与病毒载量呈现出相同的趋势;肺脏病理切片结果显示在第6天病毒组与抗体组均存在肺组织损伤,但抗体组轻于病毒组,这种效果在第10天的切片上表现更为明显。在犬体试验中,设置病毒组、阴性对照组（PBS）和抗体组。抗体组在滴鼻攻毒前48 h经皮下注射最大抗体保护剂量20 mg/kg,对不同时期犬的相关指征（体温,体重,血中相关细胞因子,血清、鼻咽拭子、肛门拭子病毒载量等）进行测定。病毒组犬出现体重减轻、体温升高等临床症状,其临床症状赋分在第6天时达到最高,显著高于抗体组和PBS组（P<0.001）,病毒组血清、鼻咽拭子以及肛门拭子病毒载量,在第2、4、6、8、10天均高于抗体组（P<0.001）。犬血清细胞因子检测结果显示,病毒组IL-6、KL-6的浓度随病程的发展先升高后降低,分别在第6天、第8天达到最高,显著高于抗体组和PBS组（P<0.05）;IFN-γ和TNF-α则呈先降后升的趋势,显著高于PBS组（P<0.05）。抗体组与PBS组在犬体重、体温、临床赋分以及各细胞因子表达水平上均无明显差异。结果表明,重组抗体能减轻犬和小鼠由病毒造成的体重减轻、发热等临床症状,在一定程度上缓解病毒对肺的损害。综上,本研究制备了具有中和活性的抗H3N2亚型犬流感病毒完全犬源化抗体,且该抗体在小鼠和犬感染模型中均显示了较好的免疫保护性。