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与一些早期基因型新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)相比,基因Ⅶ型NDV能引起以家禽免疫系统,尤其是脾脏,广泛性组织坏死和淋巴细胞损伤为特征的免疫病理变化。基因Ⅶ型NDV诱导的过激的炎性反应对脾脏的免疫病理损伤具有重要贡献,但Ⅶ型NDV诱导强烈炎性应答的机制还不完全清楚。我们前期研究发现,与基因Ⅳ型NDV Herts/33株相比,Ⅶ型毒株JS5/05可显著上调脾脏基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)的表达,造成脾脏细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)分子组成与结构的严重破坏。ECM存在于所有组织器官中,对组织内稳态和结构完整性、细胞分化和存活、信号转导、细胞迁移和侵袭等过程具有重要意义。MMP是ECM重塑的主要驱动力,MMP与ECM的相互作用影响了众多疾病的发展和病理结果,这提示MMP介导的ECM变化对Ⅶ型NDV诱导的免疫病理表型可能具有重要作用。本研究首先比较了基因Ⅶ型NDV JS5/05与Ⅳ型NDVHerts/33感染引起的鸡免疫器官及其ECM组织病理学变化,并检测了这些器官中相MMP的表达水平,鉴定引起Ⅶ型NDVECM变化的关键MMP类型。接着以鸡外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)为体外模型检测了 MMP-14 在 NDV 感染细胞中的表达和亚细胞定位,探究Ⅶ型NDV对MMP-14表达与定位的调控。建立了ECM胶原降解和Transwell细胞迁移模型,检测NDV感染细胞的胶原降解能力和细胞迁移,评价Ⅶ型NDV对MMP-14功能的调控。最后,分析胞外信号调控激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)信号通路对 NDV 感染 PBMC 中 MMP-14表达及细胞迁移的影响,初步探索NDV调控MMP-14表达的机制。此外,基于JS5/05与Herts/33互换基因片段的重组病毒,测定病毒诱导的MMP-14表达水平及细胞迁移,鉴定Ⅶ型NDV调控MMP-14表达的分子基础。我们的结果说明,基因Ⅶ型NDV激活PBMC的ERK通路,显著上调MMP-14表达及其在细胞表面的暴露水平,显著增强细胞的ECM降解与细胞迁移,这可能对基因Ⅶ型NDV诱导炎性反应与组织损伤有重要影响。1.基因Ⅶ型NDV诱导的免疫器官ECM病变与MMP表达与基因Ⅳ型NDV相比,基因Ⅶ型NDV以严重损害家禽免疫系统为特征。前期实验证明,基因Ⅶ型NDV可诱导脾脏ECM结构的显著破坏,这对其导致的病理损伤可能有重要作用。为系统比较基因Ⅶ型和Ⅳ型NDV引起的ECM组织病理学变化,本研究用ECM特异性染色,包括Masson染色法和天狼星红染色,对基因Ⅶ型NDVJS5/05株与基因Ⅳ型NDVHerts/33株感染鸡的脾脏、胸腺和法氏囊进行了 ECM组织病理学分析,并通过免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)方法检测了 ECM关键组分Ⅰ型胶原蛋白在脾脏中的分布。此外,使用qRT-PCR和Western blot方法比较了 JS5/05与Herts/33感染的免疫器官中相关MMP(MMP-1、-13和-14)的基因和蛋白表达水平,鉴定引起ECM病理变化的关键MMP类型。结果显示,与Herts/33相比,JS5/05导致的病理变化以脾脏广泛坏死为特征。ECM特异性染色以及IHC结果表明,与Herts/33相比,JS5/05显著降低脾脏ECM蛋白丰度,严重破坏胶原纤维的走向、排列与网络结构;胸腺ECM变化不明显,两病毒仅引起轻微的ECM缺失和结构破坏,差异不显著;而相比于Herts/33,JS5/05导致法氏囊中ECM胶原丰度显著下降,结构疏松。此外,JS5/05显著上调脾脏MMP-13和MMP-14基因和蛋白的表达,且MMP-14的上调幅度更大。JS5/05也使法氏囊中MMP-14的蛋白表达显著上调,但对胸腺中MMP-14的表达无显著影响。这些结果表明,鸡免疫器官(尤其是脾脏)的ECM严重降解是基因Ⅶ型NDV感染过程中特征性的病理事件,可能诱发了随后的炎症反应与免疫病理变化,而MMP-14在这一过程中可能发挥关键作用。2.基因Ⅶ型NDV对MMP-14表达、定位与功能的调控基因Ⅶ型NDV可能通过上调鸡脾脏中MMP-14诱导ECM的显著降解,进而促进炎性细胞的广泛浸润。因此,我们以鸡PBMC为体外感染模型,评价了基因Ⅶ型NDVJS5/05和基因Ⅳ型NDVHerts/33感染对MMP-14的表达、定位及其生物学功能(ECM降解和细胞迁移)的影响。首先,通过qRT-PCR和Westernblot检测了 NDV感染PBMC中MMP-14基因与蛋白的表达水平,并用流式细胞术分析MMP-14在细胞表面的表达。然后,通过激光共聚焦分析MMP-14的亚细胞定位及其转运的动态过程。随后,建立细胞的荧光胶原降解实验以直观反映NDV感染细胞对ECM胶原底物的降解程度,并建立Transwell迁移模型评估病毒感染细胞透过ECM屏障的迁移能力。最后,通过抑制MMP-14验证其在JS5/05感染PBMC中的功能活性。结果表明,JS5/05显著上调PBMC中MMP-14的基因与蛋白表达水平,且MMP-14在JS5/05感染细胞的胞膜表达水平显著增加,而Herts/33感染对MMP-14的表达影响不显著,MMP-14膜表达水平与对照组差异不明显。流式细胞术检测也表明,与Herts/33相比,JS5/05感染显著上调MMP-14在细胞表面的表达。此外,MMP-14在JS5/05感染细胞中呈现从细胞核周围向胞膜的转运过程,且最终在细胞表面积聚,但是其在Herts/33感染细胞中大多滞留于细胞质中。JS5/05感染细胞诱导的胶原降解范围显著高于Herts/33感染细胞,且MMP-14的膜表达与胶原蛋白降解区域吻合。此外,在趋化因子MCP-1的诱导作用下,JS5/05感染的PBMC的迁移能力显著增强,但是Herts/33对细胞迁移没有明显影响。MMP-14特异性抑制剂NSC405020能显著降低MMP-14在细胞膜上的表达与JS5/05感染PBMC细胞的胶原降解和细胞迁移能力。这些结果表明,基因Ⅶ型NDV诱导的MMP-14表达上调和在细胞表面的积聚引起了 ECM的显著降解,并促进PBMC在炎性趋化条件下的细胞迁移,这可能加剧了脾脏的炎性应答和免疫病理损伤。3.基因Ⅶ型NDV调控MMP-14表达的机制初探为探索基因Ⅶ型NDV调控MMP-14表达的机制,我们首先鉴定调控MMP-14表达的主要信号通路,并通过基因互换的方式鉴定Ⅶ型NDV上调MMP-14的分子基础。首先,用 Western blot 检测了Ⅶ型(JS5/05)和 Ⅳ 型 NDV(Herts/33)感染 PBMC后ERK蛋白的磷酸化,并在此基础上用抑制剂阻断ERK磷酸化,评价ERK信号通路对Ⅶ型NDV调控MMP-14表达及细胞迁移的作用。此外,我们用JS5/05和Herts/33单独或联合互换M、F、HN基因的一系列重组病毒感染PBMC,并检测MMP-14的表达水平及细胞迁移能力,鉴定Ⅶ型NDV上调MMP-14表达的分子基础。结果表明,JS5/05和Herts/33在PBMC上的复制能力相当,且均能上调ERK的磷酸化水平。但是,仅有JS5/05显著上调MMP-14表达,而Herts/33对MMP-14表达无明显影响。抑制剂U0126可显著阻断ERK蛋白磷酸化,且可以显著降低JS5/05感染PBMC中MMP-14 的蛋白表达水平及细胞迁移能力。此外,重组病毒感染实验表明,JS5/05 和 Herts/33单独替换M、F或HN基因对MMP-14表达无显著影响,而将JS5/05的F和HN共同替换至Herts/33骨架能显著提高MMP-14表达水平,将Herts/33的F和HN同时替换至JS5/05骨架则相应降低了 MMP-14的表达,且三基因共同替换同样能显著提高或降低MMP-14表达水平,但与双基因替换的效果差异不大。相应地,在JS5/05与Herts/33之间同时互换F和HN基因能使病毒诱导的细胞迁移表型发生明显反转。这些结果说明,Ⅶ型NDV感染PBMC后,ERK信号通路的激活对MMP-14表达的上调起重要作用,而F和HN基因对于Ⅶ型NDV上调MMP-14表达至关重要,且存在协同作用。