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背景与目的: 结肠癌是一种严重威胁人类生命和健康的恶性肿瘤。我国结肠癌的发病率呈逐年递增趋势，位居我国恶性肿瘤发病率的第四位。如何有效的预防和治疗结肠癌，成为医学界关注的热点问题。除了传统的手术、放疗与化疗外，进一步开发、寻找高效、低毒的药物和中西医结合治疗方案，仍是目前结肠癌治疗中有待解决的关键。天然药物因其多靶点、多环节和多途径的抗肿瘤作用，以及低毒，低副作用的特点，日渐成为临床抗肿瘤药物研究的热点。本研究的灌肠方，是从中药仙鹤草、败酱草、龙葵中提取出来的复方提取物，药理作用广泛，抗癌是其主要作用之一。氟尿嘧啶是治疗结肠癌的主要抗癌药物，具有广泛的抗肿瘤谱。因此，在深入研究灌肠方提取物的抗癌活性与作用机制的基础上，进一步探讨其与氟尿嘧啶联合的抗结肠癌作用，可为结肠癌中西医结合综合治疗的临床应用，提供有价值的实验理论基础。 方法: 应用液相色谱-质谱联用技术测定灌肠方总提物成分;MTT法检测不同浓度灌肠方醇提液对人肠癌LoVo细胞的增殖抑制率;流式细胞术检测灌肠方醇提液对LoVo细胞凋亡的影响;transwell小室、细胞粘附实验、细胞划痕实验检测灌肠方醇提液对LoVo细胞侵袭，粘附，迁移的影响;RT-PCR检测灌肠方醇提液对LoVo细胞Ras/Raf/MEK/ERK信号通路相关分子(Raf，MEK1/2，ERK1/2)和Bax，Bcl-2，NF-κ BmRNA的表达;Western blot法检测灌肠方醇提液对LoVo细胞Ras/Raf/MEK/ERK信号通路相关分子(Raf, P-Raf, MEK1/2，P-MEK1/2，ERK1/2, P-ERK1/2)和Bax, Bcl-2, procaspase-9, procaspase-3, NF-κB蛋白表达的变化;根据荷肠癌LoVo细胞裸鼠移植瘤的体积和重量计算灌肠方提取液的抑瘤率;HE染色光镜观察肿瘤组织的形态结构。免疫组织化学法检测灌肠方提取物对肿瘤组织Ras/Raf/MEK/ERK信号通路相关分子蛋白的表达。采用流式细胞术、Hoechst实验、RT-PCR、免疫组织化学染色等技术研究了灌肠复方联合氟尿嘧啶的体内外抗结肠癌作用及相关机制。主要研究结果总结如下: 结果: 1、灌肠方提取液主要的化学成分为:儿茶素、花旗松素、槲皮苷、鞣花酸、槲皮素、木犀草素、澳洲茄碱、澳洲茄边碱、澳洲茄胺9种成分，在醇提物中7种成分高于水提物。提示醇提液的成分明显高于水提液。 2、灌肠方醇提液可抑制LoVo细胞的增殖活性并具有明显剂量和时间依赖性。在处理细胞24、48和72h，灌肠方对LoVo细胞的IC50分别为:5.67±0.21 mg/mL，3.49±0.23mg/mL,1.74±0.04 mg/ml。 3、7mg/mL灌肠方醇提液干预LoVo细胞48h后RT-PCR结果提示Raf、MEK1/2、ERK1/2、Bcl-2、NF-κB mRNA表达明显降低，而BaxmRNA表达明显增加(P＜0.05)，Westernblot结果提示p-Raf、p-MEK1/2、p-ERK1/2、Bcl-2、NF-κ B、procaspase-9，procaspase-3蛋白表达降低，而Bax蛋白表达增加，同样具有明显的剂量依赖性。 4、7mg/ml、0.87mg/ml、0.21mg/ml浓度灌肠方作用LoVo细胞48h有明显的抑制侵袭粘附转移作用，3种浓度对LoVo细胞的侵袭抑制率分别为83.76％、58.18％、31.76％(P＜0.01) 5、灌肠方对LoVo细胞裸鼠皮下移植瘤HE染色显示:空白对照组，癌细胞较大，胞浆丰富，可见大量的核分裂，大量炎细胞浸润;实验组随着灌肠方剂量的增加，核分裂、炎症细胞浸润逐渐减少，并可见凋亡/坏死。大、中、小剂量组的灌肠方提取液抑瘤率分别为:65.85％、39.9％、24.47％。免疫组化显示灌肠方组P-MEK1/2，Cox-2、VEGF、procaspase-9、procaspase-3、Bcl-2蛋白表达降低(P＜0.05)，Bax蛋白表达增加，且随着剂量的增高，作用逐渐增强。 6、在协同实验中发现，灌肠方能抑制LoVo细胞增殖，使LoVo细胞发生明显的形态学改变，灌肠方可在mRNA水平上调氟尿嘧啶疗效相关基因OPRT的表达，下调TS、DPD基因表达水平，从而协同5-Fu诱导肿瘤细胞凋亡。 7、裸鼠移植瘤实验发现，灌肠方能抑制LoVo细胞裸鼠移植瘤的生长，且与氟尿嘧啶联合应用对移植瘤生长抑制产生协同效应，单药氟尿嘧啶、灌肠方以及联合用药肿瘤抑瘤率分别为42.7％、37.52％、67.33％(P＜0.05)。 总之，灌肠方可以通过细胞毒作用、诱导凋亡作用使肿瘤细胞生长停滞并逐渐走向死亡，与氟尿嘧啶联用对LoVo细胞生长具有协同抑制效应。灌肠方与氟尿嘧啶联合应用于结肠癌的治疗，增加了抗癌作用，并且未出现两药毒性重叠现象，提示灌肠方与氟尿嘧啶联合治疗结肠癌具有可行性，值得在临床推广应用。 结论: 1、灌肠方提取液可从基因转录和蛋白表达两个层面调控Ras/Raf/MEK1/2/ERK1/2和NF-κB信号转导通路中多个分子的表达，从而发挥其抑制LoVo细胞的增殖，侵袭转移，诱导细胞凋亡。 2、灌肠方提取液能在RT-PCR水平上调氟尿嘧啶疗效相关基因OPRT的表达，下调TS、DPD基因表达，协同5-Fu，发挥抑制LoVo裸鼠移植瘤的生长作用。 3、灌肠方是一种安全的、有潜力的可以治疗恶性肿瘤的经典方剂，值得进行深入研究。 本实验拟通过中药复方灌肠方对LoVo细胞的研究，渴望在中医药抗肿瘤领域有所突破。因此，本实验通过从整体动物、细胞和分子生物学的水平，研究灌肠方对人结肠癌移植瘤的抑瘤作用及对Ras/Raf/MEK1/2/ERK1/2细胞信号通路的影响，抗肿瘤细胞生长、脱落、转移、促进肿瘤细胞凋亡的实验研究;探索灌肠方对LoVo细胞裸鼠移植瘤功能的影响。从而深入研究灌肠方的药理药效，探索中药复方灌肠方协同小剂量氟尿嘧啶治疗肠癌的新思路，为探求灌肠方对消化道恶性肿瘤的治疗奠定理论基础，对丰富中医理论内涵和开发抗大肠癌中药新药具有重要意义。