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铅是对人类、动物及环境均有危害的重金属。人类活动和工业生产致使铅污染扩散至全球范围,造成全球性的威胁。长期接触低浓度铅会导致体内铅蓄积,并引起造血、泌尿、生殖、免疫、神经、血管和消化系统的慢性损伤。在细胞中,铅会导致亚细胞结构主要是内膜系统、线粒体与核糖体等细胞器破坏,引起细胞内氧化应激压力增大,对遗传物质造成损伤,并诱导细胞凋亡。铅诱导细胞凋亡是其对机体造成损伤的原因之一。目前对于铅胁迫诱导细胞凋亡的研究已有很多,但其机制仍未十分明确。本研究以日本三角涡虫为研究对象,通过铅胁迫(80 mg/L)不同时间(12 h、24 h、36 h、48 h),检测涡虫在铅急性毒性条件下细胞凋亡的发生及其与Ca2+水平、Caspase-3、Caspase-8、Cyt-c、CaM等的关系。同时,研究究钙离子螯合剂BAPTA-AM(20 μM)对铅毒理作用及细胞凋亡的影响。通过上述一系列指标的分析,阐释铅胁迫诱导涡虫细胞产生凋亡的主要路径和机制。本实验分组包括对照组(C组)、铅处理组(E组)、铅和BAPTA-AM共同处理组(T组)以及铅处理后再加入BAPTA-AM6小时处理组(Ⅰ组)。研究获得的主要结果如下:1.涡虫受铅胁迫后表现出明显的形态变化、活动能力下降、失去避光性以及死亡的现象。Hoechst 33258染色证明,铅胁迫诱导涡虫细胞凋亡比率显著升高,BAPTA-AM可显著抑制细胞凋亡水平并减少凋亡细胞数量。2.暴露于铅溶液中36小时,与对照组相比,涡虫细胞中的cleaved Caspase-3表达量及Caspase-3活性显著升高。在T组和Ⅰ组中,加入BAPTA-AM,Caspase-3活性相比E组被显著抑制。说明铅胁迫36小时,涡虫细胞凋亡通路被激活。而BAPTA-AM能显著抑制铅胁迫诱导的Caspase-3活化。3.暴露于铅溶液中24小时,与对照组相比,涡虫细胞中的Ca2+浓度显著上升,并在48小时内,Ca2+浓度随处理时间延长而持续升高。与E组相比,在T组和Ⅰ组中,加入BAPTA-AM,铅胁迫诱导的Ca2+浓度上调均被显著抑制。4.暴露于铅溶液后,涡虫细胞中的p-CaM表达量与对照组相比显著升高;在T组和Ⅰ组中,加入BAPTA-AM处理,与E组相比,均能显著抑制p-CaM表达水平。说明BAPTA-AM可通过抑制铅胁迫诱导的Ca2+过量降低CaM的活化水平。5.暴露于铅溶液后,涡虫细胞中的cleaved Caspase-8表达量显著高于对照组;在T组和Ⅰ组中,与E组相比,加入BAPTA-AM处理,均能显著降低cleaved Caspase-8表达水平。说明BAPTA-AM可显著抑制铅胁迫诱导的cleavedCaspase-8表达升高。6.涡虫暴露于铅溶液中,在48小时内的不同时间段里,涡虫胞质中的Cyt-c蛋白含量没有明显变化。在T组中,涡虫胞质及线粒体中的Cyt-c含量均无显著性变化。在Ⅰ组中,处理36小时后胞质蛋白中Cyt-c蛋白含量显著升高;在处理48小时左右,胞质中的Cyt-c蛋白含量显著高于对照组与E组。此结果显示在铅胁迫下Caspase-3不是在Cty-c从线粒体释放到胞质后激活的,说明内源性凋亡通路并不是铅胁迫诱导涡虫细胞凋亡的主要途径,但停止铅胁迫后加入BAPTA-AM处理6小时,会导致内源性凋亡通路补偿性激活。结论:综合上述实验结果表明,铅胁迫下涡虫细胞内Ca2+水平的剧烈增加,是铅诱导涡虫细胞凋亡的主要原因,并且加入Ca2+螯合剂BAPTA-AM处理可显著抑制铅诱导的涡虫细胞凋亡。此外在铅胁迫诱导涡虫细胞凋亡过程中内源性凋亡通路处于静默状态,停止铅胁迫后再加入BAPTA-AM处理6小时,虽然显著降低了铅诱导的Ca2+水平变化,但内源性通路被补偿性激活。