艾灸血清对cajal间质细胞内、外游离Ca2+浓度及IP3R、RyR表达的影响

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目的:以功能性消化不良Cajal间质细胞(ICC)为研究对象,研究艾灸足三里大鼠血清对40-60gSD乳鼠小肠Cajal间质细胞(Interstitial cells of cajal, ICC)内三磷酸肌醇受体(Inositol1,4,5-trisphosphate receptor, IP3R)和斯里兰卡肉桂碱受体(Ryanodinereceptor, RyR)表达的影响,以及探索该细胞内外钙离子的浓度,揭示艾灸足三里治疗功能性消化不良,调节胃肠运动的作用机制。方法:1、制备血清,先将12只SD大鼠进行随即分为三组,正常组,模型组,艾灸组,每组4只。除正常组外,其余2组大鼠依据中医理论和消化不良的病因学理论模拟FD动物模型按文献介绍的方法,采用夹尾刺激引发大鼠打斗造模方法经行造模,造模7天。造模结束后艾灸组大鼠给予艾灸足三里治疗10天,其他2组大鼠在艾灸组治疗的同时给予捆绑刺激;3组大鼠均按1ml/100g·d的剂量灌服生理盐水10d,10d后制备相应组血清。2、分离SD乳鼠小肠ICC,进行无菌条件下原代培养,并用反复贴壁法对细胞进行纯化,经形态学观察和免疫荧光学鉴定确定为该细胞后,用功能性消化不良模型动物血清建立“功能性消化不良ICC模型”。3、采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测Cajal间质细胞内IP3R, RyR m RNA的含量,微板法检测Cajal间质细胞内、外Ca2+浓度的变化,Western-Blot法检测Cajal间质细胞内IP3R、RyR的蛋白表达,从而揭示艾灸足三里治疗功能性消化不良调节胃肠运动的作用机制。结果:1、ICC形态学观察及免疫荧光学鉴定:倒置显微镜下观察ICC形态学变化:体外培养成功的ICC具有特殊的形态特征。原代ICC接种于培养瓶或培养板中,24h即可贴壁变形,细胞呈三角形或梭形,可有少量短突起。第3天可见细胞形成与神经轴突类似的长突起。7天后,ICC可以伸出二级、三级突起、突起间可相互连接成复杂的网状结构,这种连接是其慢波功能的结构基础。免疫荧光学鉴定:在免疫荧光显微镜下观察ICC表面C-kit呈阳性,胞体和突起均显著着色,部分细胞发出长突起。功能性消化不良ICC细胞模型建立:通过形态学观察,功能性消化不良模型细胞形态发生明显变化:细胞变扁平,突触连接紧密,细胞缝隙变小,网络连接不明显。2、与正常培养的Cajal间质细胞相比,FD大鼠血清干预后的Cajal间质细胞内Ca2+浓度下降(P<0.01),细胞外Ca2+浓度上升(P<0.05);与FD大鼠血清干预后Cajal间质细胞相比,艾灸FD大鼠足三里血清干预后的Cajal间质细胞内Ca2+浓度上升(P<0.01),细胞外Ca2+浓度下降(P<0.01)。3、Western-Blot法检测结果显示,与正常培养的Cajal间质细胞相比,FD大鼠血清干预后的Cajal间质细胞内IP3R、RyR的蛋白表达均下降(P<0.01);与FD大鼠血清干预后Cajal间质细胞相比,艾灸FD大鼠足三里血清干预后的Cajal间质细胞内IP3R、RyR的蛋白表达均上升(P<0.01)。4、RT-PCR法检测结果显示,与正常培养的Cajal间质细胞相比,FD大鼠血清干预后的Cajal间质细胞内IP3R、RyR m RNA的含量均下降(P<0.01);与FD大鼠血清干预后Cajal间质细胞相比,艾灸FD大鼠足三里血清干预后的Cajal间质细胞内IP3R、RyR mRNA的含量均上升(P<0.01)结论:1、原代ICC细胞培养成功:从SD大鼠乳鼠小肠组织中可成功分离并培养出Cajal间质细胞。2.、功能性消化不良ICC细胞模型建立成功:功能性消化不良模型大鼠血清加入正常ICC细胞之后,成功复制功能性消化不良ICC细胞模型。3.、艾灸FD大鼠足三里血清对Cajal间质细胞内、外Ca2+浓度及IP3R、RyR蛋白表达及m RNA含量的异常变化具有调节作用。
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