【摘 要】
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研究背景十型胶原蛋白基因（COL10A1）在肥大型软骨细胞的特异表达是软骨内成骨发育的重要环节。人类COL10A1基因突变或异常表达常伴有软骨细胞成熟受损并见于Schmid干骺端发育不良或其它多种骨骼疾病。Col10a1基因缺失小鼠也同样具有骨骼生长板等异常。因此,阐明十型胶原蛋白基因的调控对于了解骨骼发育与疾病至关重要。本实验室前期已成功将Col10a1基因增强子定位于其远端启动子150bp的序
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研究背景十型胶原蛋白基因（COL10A1）在肥大型软骨细胞的特异表达是软骨内成骨发育的重要环节。人类COL10A1基因突变或异常表达常伴有软骨细胞成熟受损并见于Schmid干骺端发育不良或其它多种骨骼疾病。Col10a1基因缺失小鼠也同样具有骨骼生长板等异常。因此,阐明十型胶原蛋白基因的调控对于了解骨骼发育与疾病至关重要。本实验室前期已成功将Col10a1基因增强子定位于其远端启动子150bp的序列,并确定Runx2可与该增强子结合,是介导Col10a1在肥大型软骨细胞中特异表达不可或缺的转录调控因子。同时,通过生物信息软件TRAP还预测出多个可能与该150bp Col10a1增强子结合的转录调节因子,包括Dlx5,Nrf2,Hoxa3等。值得注意的是,Dlx5（Distal-Less Homeobox 5）与Col10a1增强子的结合位点与Runx2的位点毗邻,提示Dlx5可能参与调节小鼠Col10a1基因的表达。研究目的本研究拟探讨Dlx5参与小鼠Col10a1基因表达的调控和机制以及潜在的对软骨细胞分化成熟的影响。研究方法（1）运用生物信息学软件JASPAR验证转录因子Dlx5,Nrf2,Hoxa3等是否与150bp Col10a1基因增强子序列结合。（2）应用q RT-PCR、Western blot分别检测由温度敏感性SV40大T抗原转化而来的永生化的软骨细胞MCT细胞在32℃（32℃培养时为增殖型软骨细胞模型）与37℃（37℃培养时为肥大软骨细胞模型）培养条件下Dlx5与Col10a1基因表达水平。（3）采用lipo3000分别瞬时转染Dlx5表达质粒pcDNA3.1/Dlx5与Dlx5干扰片段si RNA-A于MCT细胞中,q RT-PCR、Western blot分析Dlx5对Col10a1基因表达的影响。（4）双荧光素酶报告基因实验分析Dlx5对Col10a1基因增强子活性的影响。（5）干预MCT细胞中Dlx5表达后,q RT-PCR、Western blot检测Dlx5对软骨细胞成熟相关基因表达的影响。（6）干预MCT细胞中Dlx5表达后,乙炔基脱氧尿苷分析（Ethynyldeoxyuridine analysis,Ed U）分析Dlx5对MCT细胞增殖的影响。研究结果（1）JASPAR预测结果显示,Dlx5与150bp Col10a1增强子的结合位点同TRAP软件预测结果一致。（2）q RT-PCR、Western blot结果表明,Col10a1与Dlx5的m RNA水平在肥大期均高于增殖期（p<0.05）,蛋白水平在肥大期也明显高于增殖期。（3）q RT-PCR和Western blot结果显示,转染pcDNA3.1/Dlx5质粒后,MCT细胞中Dlx5与Col10a1的m RNA水平与对照组相比显著上升（p<0.05）,蛋白水平也明显提高;转染Dlx5干扰片段si RNA-A后,MCT细胞中Dlx5与Col10a1的m RNA水平与对照组相比显著下降（p<0.05）,蛋白水平也明显下降。（4）双荧光素酶报告基因结果显示,与对照组相比,过表达Dlx5增强150bp Col10a1增强子活性（p<0.05）。（5）q RT-PCR和Western blot结果显示,转染pcDNA3.1/Dlx5后,MCT细胞中Runx2的m RNA水平与对照组相比显著上升（p<0.05）,蛋白水平也明显升高,而Sox9与Mmp13的表达水平则无明显变化;转染Dlx5 si RNA-A后,与对照组相比,MCT细胞中Runx2的m RNA水平显著下降（p<0.05）,蛋白水平也明显降低,而Sox9水平无明显改变,Mmp13 m RNA水平无明显变化,蛋白水平降低。（6）Ed U细胞增殖成像结果显示,与对照组相比,过表达Dlx5后抑制MCT细胞增殖,而干扰Dlx5后对MCT细胞增殖无明显影响。研究结论（1）Dlx5能够提高Col10a1增强子的活性,促进肥大软骨细胞中Col10a1的表达,是Col10a1基因表达的正向调控因子。（2）Dlx5促进软骨细胞中Runx2的表达,可能与Runx2协同调节Col10a1基因表达以及软骨细胞的分化与成熟。
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