论文部分内容阅读
柳树黄化病由柳树黄化植原体(Willow Yellow Phytoplasma, WY)引起的病害,由过去的零星发病逐渐蔓延开来,近年来在华北、西北地区成片发生,柳树感病后叶片发黄树干逐渐枯死,造成了巨大的经济损失,严重阻碍了柳树产业的发展。由于柳树黄化植原体严格寄生于韧皮部,不能进行人工培养,因而对其遗传本质、生化特性及分子机理的研究都比较缺乏。到目前为止,国外除Lee对柳树黄化植原体的介绍和初步的分类文献外,我国主要将16S rRNA基因用于带病检测,对该植原体相关基因序列均无文献报道,对病原的分类地位也没有明确。本研究首次对我国柳树黄化病病株杨凌分离物(WY- YL)的植原体16S rRNA基因和rp基因进行克隆和序列测定,并进行了RFLP分析,首次确定了该植原体的分类地位。研究结果如下:(1)利用植原体16S rRNA基因保守序列通用引物对Rm16F2/Rm16R1和R16F2/R16R2,应用巢式PCR技术从柳树黄化病株叶片中扩增到了1.2kb(GenBank登录号FJ179166)的特异片段。表明G+C的含量为46.74%,符合植原体16S rRNA基因G+C含量(45%～49%)。通过同源性比较可知,我国WY- YL与16S rI组植原体16S rRNA基因序列的同源性均达99%以上,其中与16S r I-C亚组的同源性最高,特别是与小麦蓝矮植原体(WBD)同源性达99.8%,而与其它组的同源性均低于97.5%据此可以判定柳树黄化病植原体是属于植原体16S rI组。(2)根据已发表的16S rI组植原体的核糖体蛋白基因序列设计特异性引物,从柳树黄化植原体中分离并克隆了核糖体蛋白rp基因,长1212bp,(GenBank登录号FJ179167)。通过同源性比较可知,柳树黄化植原体WY-YL与16S rI组中的各亚组代表植原体rp基因核苷酸同源性均达到96%以上,其中与16S rI-C亚组WBD序列亲缘关系最近,核苷酸同源性达99. 6%。(3)柳树黄化病植原体转运蛋白secY基因的克隆与序列分析:扩增的secY基因片段大小为1358bp,包含一个完整的secY基因,编码413个氨基酸。柳树黄化病植原体secY基因与16S rI-C亚组的小麦蓝矮植原体以及三叶草绿变植原体(CPh、KVE和KVG )明显聚为一个分支,说明柳树黄化病植原体属于16S rI-C组。从亚组的水平上确定了柳树黄化病植原体的分类地位。利用ANTHEPROT5.0软件对转运蛋白secY基因的分子特性进行分析,可知该蛋白的分子量为45.9KDa。二级构象中,螺旋形式占60%,折叠占17%,为无规则卷曲占17%,无转角形式。具有九个跨膜区,存在有潜在信号肽切割位点,切割位点主要位于第100-250个氨基酸之间,其中第216个氨基酸残基(苏氨酸)处为最强切割位点,在该蛋白其他部位也发现很弱的潜在信号肽切割位点。(4)对16S rRNA用KpnI, HaeIII, EcoR I, HinfI ,Dra I , HhaI和TaqI进行RFLP分析,同时对rp用AluI和TaqI进行酶切分析,结果显示:柳树黄化植原体和16S rI-C亚组的WBD的酶切图谱都一致,且与Lee等对34种植物的植原体16S rRNA RFLP分析图谱进行对比,发现与Lee酶切结果中的16SrI-C亚组条带完全一致,说明WY应属于16S rI-C亚组。而与16S rI-D亚组泡桐丛枝植原体用HaeIII和HhaI酶切的结果不同,说明柳树黄化植原体与泡桐丛枝植原体分属于不同亚组。AluI和TaqI对rp基因的酶切条带显示WY与WBD的酶切结果一致,且与Lee酶切结果中的16SrI-C亚组条带完全一致,但与PaWB不同.也说明了WY为16S rI-C亚组植原体。