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猪链球菌2型（S. suis2）是一种致病力强、临床分离率高的重要人畜共患病原菌，有效防控S. suis2感染具有重要的公共卫生学意义。源自猪链球菌7型溶原性噬菌体编码的裂解酶 Ly7917，对猪链球菌多种血清型均具有显著的裂解效果。生物信息学功能预测分析显示，Ly7917具有一个N端半胱氨酸-组氨酸依赖型酰胺酶/内肽酶（CHAP）催化结构域和C端SH3b结合结构域，分别发挥催化裂解和结合靶定目标细菌肽聚糖位点功能。为了深入解析Ly7917裂解酶的生物学特性、酶学特征以及基于结构生物学的裂菌机制，本文系统研究了 Ly7917的理化特性、体内外裂菌活性和抗菌效果，开展了裂解酶结晶和三维晶体结构解析并阐明了裂解酶与底物互作和裂解机制。 为了解析裂解酶Ly7917的体外裂菌特性，采用原核系统表达、纯化了Ly7917蛋白并测定其生化特性。平板裂解试验和浊度递减试验结果显示，4.5 mg/mL Ly7917对猪链球菌2型高致病力菌株HA9801的裂解效果比较明显，酶活性单位达到114 U/mg。裂菌谱试验结果显示，Ly7917对大部分不同血清型的猪链球菌均具裂解能力，其中对2型菌株HA05729-2的裂解效率最高，可使其浊度下降大于40%，对金黄色葡萄球菌ATCC25923的裂解，也可导致浊度下降达10%，但对大肠杆菌等革兰阴性菌无裂解能力。常见二价金属离子中，Ca2+添加对Ly7917裂菌活性有显著增强作用，1.25 mM Ca2+可促使Ly7917裂解HA9801的能力增强20%；Mg2+、Zn2+和Co2+对Ly7917活性无显著影响，而Fe2+和Cu2+对Ly7917活性有抑制作用。EDTA添加量大于50 mM后Ly7917活性基本消失。Ly7917偏爱碱性环境，pH小于4.5后裂解活性丧失；还原剂DTT对 Ly7917活性的影响不显著；Ly7917能耐受一定的环境温度，在42℃至少可保持活性15分钟。Ly7917广谱、高效、稳定的裂菌活性为其实际应用提供了条件。 为了揭示裂解酶Ly7917体内裂菌和抗感染效果，分别建立了小鼠腹腔感染和肌肉切口感染两种体内治疗模型。在腹腔攻击-腹腔治疗模型中，猪链球菌2型HA9801对BALB/c小鼠的攻毒剂量为1.4×108 CFU/只，Ly7917裂解酶和青霉素G对HA9801的最小抑菌浓度分别为64 U/mL和625 U/mL。BALB/c小鼠腹腔注射HA98011.4×108 CFU后3 h，分别用Ly7917裂解酶和青霉素G腹腔注射治疗3 h后，Ly7917治疗组小鼠血液细菌浓度下降至1–12×104 CFU/mL，青霉素G治疗组小鼠血液细菌含量为1–5×107 CFU/mL，而不治疗对照组小鼠血液细菌浓度达到2–18×108 CFU/mL。Ly7917治疗组小鼠的存活率为90%，而青霉素G治疗组为50%，阴性对照组为20%。在肌肉切口感染-腹腔治疗小鼠模型中，Ly7917治疗组小鼠血液中检测不到细菌，而不治疗对照组小鼠血液细菌浓度最高可达106 CUF/mL。小鼠抗感染结果显示，Ly7917在动物体内可快速有效裂解猪链球菌，呈现出优异的保护力。 为了阐明裂解酶 Ly7917的结构及其与底物的作用机制，将纯化浓缩后的Ly7917蛋白采用座滴式气相扩散法进行结晶筛选后，成功获得高质量的Ly7917晶体，衍射质量达1.9?。通过采用SAD法解析相位、phenix精修和coot调校等技术与方法，发现一个单晶胞体中含有两个Ly7917分子，成功解析了Ly7917的三维晶体结构（PBD code：5D74），其CHAP催化结构域和SH3b结合结构域的三维结构分别与蛋白4f88和4lxc的高度重叠。在此基础上，获得Ly7917与肽聚糖通用底物MDP水解产物的复合物晶体并解析（PBD code：5D76），衍射质量达2.5?。分析结果提示Ly7917发挥酰胺酶活性，裂解MDP中乙酰胞壁酰与L-丙氨基之间的酰胺键。水解产物L-丙氨基-D-异谷氨酰胺与SH3b的主要结合位点为176A、180R。 为了解析裂解酶 Ly7917的催化活性区域及关键氨基酸位点，构建一系列Ly7917截短蛋白及点突变蛋白。结果显示N端截短蛋白Ly791717–245的活性完全丧失，Q14和S17点突变后Ly7917蛋白的裂解活性亦丧失。裂解酶催化结构域LyCHAP的活性与Ly7917全酶的活性相当，LyCHAP的N端序列对其活性影响较大，不宜截短；而C端依次截短后，活性逐渐降低，LyCHAP1–100为保持裂解活性的最小结构，也是Ca2+结合区域，在添加1 mM Ca2+后LyCHAP1–130活性最强，可媲美Ly7917全酶。176A和180R虽然是底物结合位点，但是点突变后对Ly7917的裂解活性无影响。 综上所述，本文系统研究了 Ly7917的体内外裂菌活性，并基于Ly7917全酶的三维晶体结构解析，阐明了裂解酶的底物识别和细菌裂解机制，发现了可供改造的功能域和关键活性位点，为进一步应用噬菌体裂解酶开展临床研究及药物开发提供理论依据。