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光受体蛋白,如蓝细菌光敏色素,吸收的光波长范围跨度十分广泛,从近紫外(~350 nm)到远红光(~750 nm)的光波都可以被吸收并转化成生物信号,调控生物体内的各种信号通路。光受体蛋白可以在时间和空间上实现对生物途径精确而灵敏的控制,是作为开发荧光蛋白、生物传感器、光遗传学工具的广阔资源。其中,光遗传学调控由于可以赋予研究者对生物途径“on-off”开关模式的控制能力而备受瞩目。本文采用了来自于蓝细菌Synechocystis sp.PCC6803中的蓝细菌光敏色素CBCRs Slr1393g3,它是一个典型的红/绿光开关,又称RGS(Red-Green switchable protein),可以共价连接藻蓝胆素,它的红光基本态的吸收峰在649 nm,绿光激发态在535 nm。将RGS通过C端α螺旋与一个蓝光受体(LOV)调控的腺苷酸环化酶(Adenylyl Cyclase,AC)融合,得到一个红/绿光调控的腺苷酸环化酶,为了使RGS对AC具有调控能力,在两者的接头处做了一系列截短突变。最终筛选得到的融合蛋白RGS?14-?4AC在体外条件下绿光态的催化能力是红光态的2.2倍,当反应温度提高到35℃时,可以达到3倍。在缺乏内源性腺苷酸环化酶的大肠杆菌体内表达时,经过14h诱导表达的绿光态蛋白活性是红光态的10倍。另一个融合蛋白RGS?7-?4AC在RGS的C端比RGS?14-?4AC多了7个氨基酸,正好是一个α螺旋的长度,它在绿光态下的催化活性是红光态的1.6倍,证明光照对RGS产生的构象改变通过α螺旋传导到了AC,成功的调控了AC的活性。虽然RGS对AC的调控能力不强,但是也证明了CBCRs作为光遗传学工具是可行的,为之后对CBCRs的研究奠定基础。近年来,多个在天然状态下连接胆绿素的CBCRs在海洋藻(Acaryochloris marina)中被发现,本文以Slr1393g3为模板,用随机诱变结合定点突变的方法,筛选得到可以连接胆绿素的一系列突变体。这一系列的突变体的光谱由原先的红光和绿光响应,转变为远红光和红光响应。其中的突变体Variant4-1的远红光基态Pfr的吸收峰在695 nm,红光激发态Pr的吸收峰在635 nm。根据结构分析,F474I的点突变对胆绿素的连接尤为重要,474位的苯丙氨酸原本处于藻胆色素的D环附近,而胆绿素的D环相对于藻胆色素在空间上向外延伸,苯丙氨酸的侧链苯环阻碍了胆绿素的连接。532位的天冬氨酸对BV的连接也有明显的影响,这个位点突变后会导致突变体光谱发生特殊的改变。虽然实验最终没有得到完美的连接胆绿素的突变体,但是本次实验得到的对于CBCRs从藻胆色素转为胆绿素连接的实验结果对于之后其它的CBCRs的突变转化具有一定的指导作用。蓝藻中的捕光装置被称为藻胆体(phycobilisome,PBS),PBS是一个由多个亚单位组成的大型复合物。PBS在缺氮、硫、会由于PC和APC的转录合成抑制和降解而出现漂白效应,使蓝藻细胞由原来的蓝绿色变为黄绿色,而NblA和NblB被认为介导了这一过程。NblB的序列与裂合酶CpcE/F中的CpcE同源性很高,通过将NblB与CpcF一起催化色素从CpcA-PCB上脱离,发现NblB联合CpcF可以起到微弱的类似于CpcE/F的功能。通过在CpcE/F的反应体系中加入NblA和NblB发现:NblA对CpcE/F的催化功能具有抑制作用,并且NblA的抑制能力随着自身浓度的提高而增强;NblB对CpcE/F的催化功能具有微弱的增强作用。通过以上实验说明,NblA与NblB的功能可能不仅仅局限在藻胆体降解上,可能与藻内的其他生物途径也有关系。