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目的:构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)cag PAI中基因cagX缺失株,探讨该基因对cagY、cagW、cagN基因表达的影响、在CagA转运过程中的作用及对细胞GES-1 IL-8 mRNA表达能力的影响；提取并纯化CagX重组蛋白,免疫BALB／c小鼠,制备多克隆抗体,明确CagX的亚细胞定位及与尿素酶、过氧化氢酶等的关系。为深入探讨幽门螺杆菌的致病机制研究奠定基础。
方法:
1.根据GenBank中收录的H.pylori26695全基因组序列,设计扩增cagX基因缺失株的同源臂引物,用PCR方法从H.pylori NCTC11637基因组DNA中扩增cagX基因同源臂片段,将克隆片段连至pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5a,再将片段定向插入含卡那抗性pBlueKM40载体中,经酶切鉴定分析,将自杀质粒命名为pBlueKM40-△cagX；
2.构建好的自杀质粒与H.pylori11637转入电击杯,利用同源重组原理,构建cagX基因缺失株,自杀质粒电击转化进入幽门螺杆菌,通过抗生素平板进行传代筛选,通过PCR方法验证cagX基因缺失株H.pylori11637△cagX的获得,提取cagX基因缺失前后细菌总RNA,逆转录为cDNA,以cDNA为模板PCR检测基因cagY,cagW,cagN的表达；
3.将cagX基因缺失株和野生株与正常胃上皮细胞GES-1进行共培养,然后采用Western blot的方法检测H.pylori转运CagA蛋白的能力,提取细胞总RNA,采用实时荧光定量PCR检测IL-8 mRNA的表达；
4.将原核表达的CagX蛋白用Ni2+-NTA柱进行分离纯化,纯化的蛋白CagX与弗氏佐剂充分乳化后,免疫BALB／c小鼠,制备多克隆抗体,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中抗体效价；
5.收集H.pylori,重悬并裂解菌体,收集细菌总蛋白,经超高速离心分离得到菌体各组分蛋白,包括周质间隙蛋白、胞质蛋白及内外膜蛋白,利用Western Blot法检测CagX蛋白的亚细胞定位；细菌总蛋白再与protein A／G plus agarose珠子混合,利用CagX抗体分离出相关蛋白,SDS-PAGE分析与CagX相关的蛋白；
结果:
1.经过PCR及与载体连接,成功构建了幽门螺杆菌cagX基因的自杀质粒pBlueKM40-△cagX,经电击转化抗生素筛选获得了cagX基因的缺失株。
2.提取H.pylori野生株及cagX基因缺失株总RNA,逆转录为cDNA,并以其为模板检测cagX上下游基因cagW、cagT及伴侣蛋白cagN基因表达变化,结果显示cagX基因缺失后,上下游基因表达量均受到影响,而cagN基因表达并没有变化。
3.将野生株与cagX基因缺失株分别与正常胃上皮细胞GES-1共培养后,Westernblot检测结果发现,cagX基因缺失株处理组中未检测到的CagA的转运,而野生株中CagA转运成功。
4.野生株与cagX基因缺失株分别与正常胃上皮细胞GES-1共培养后,提取细胞的总RNA逆转录成cDNA后,RT-PCR检测细胞因子IL-8mRNA的表达,结果发现cagX基因缺失后IL-8mRNA表达受到影响；
5.cagX-pET32a原核表达重组质粒,在浓度1mmol／L IPTG,温度30℃,诱导时间4h条件下诱导,利用Ni2+-NTA柱进行分离纯化；纯化的CagX蛋白免疫BALR／c小鼠,获得CagX融合蛋白多克隆抗体,效价为1:3.2×105；Western Blot结果显示CagX蛋白定位于菌体内外膜；免疫共沉淀及质谱结果发现,CagX与尿素酶、过氧化氢酶等有关。
结论:成功构建了cagX基因自杀质粒及缺失株,与野生株比较,cagX的缺失影响其上下游基因cagY.cagW的表达,但对cagN的表达没有影响；在与正常胃上皮细胞GES－1的共培养中,cagX的缺失可以影响CagA蛋白的转运,对GES-1细胞的IL-8mRNA的表达也有一定影响,它是H.pylori四型分泌系统(T4SS)的重要组成成分,可能负责转运CagA的转运；提取纯化重组蛋白CagX,免疫BALB／c小鼠获得CagX多克隆抗体,Western blot方法检测CagX亚细胞定位于内外膜,通过免疫共沉淀的方法,分析与CagX相关的蛋白有尿素酶、过氧化氢酶等。