花青苷生物合成途径中主要的反应步骤基本上很明确了,但是对于其调控机制的研究仍然不是很清楚。Ugt79b1编码花青苷糖基转移酶,该酶催化UDP活化木糖连接到花青苷3-O-葡萄糖基的2′′位置上,该反应对于花青苷的稳定有重要作用。Ugt79b1基因与花青苷途径中后期生物合成基因的表达具有同步性,表明ugt79b1基因与花青苷合成基因具有相似的表达调控机制。本工作希望通过研究ugt79b1基因的启动子的转录调控功能为进一步揭示花青苷的转录调控机制提供基础数据。1、本工作首先从拟南芥基因组中克隆了ugt79b1基因的启动子区片段。该片段全长只有548bp,相对较短的启动子区长度也有助于对启动子转录功能的研究。将该启动子区序列在网站上进行了转录因子结合位点的预测分析。该启动子区含有数个光调控相关的信号位点,1个生长素信号调控位点,2个光和脱落酸共用的信号调控位点,另外还有胚乳表达相关的信号位点以及细胞周期调控相关信号位点等。2、根据ugt79b1基因启动子区上调控信号位点的分布情况,将该启动子区分成三部分。第一段为5′端的211个碱基,该段含有多个光调控位点和一个生长周期调控位点。第二段为5′端212碱基到411碱基位点处,全长200bp,该段含有1个生长素调控相关位点,2个脱落酸相关位点,另含有1个可能是与胚乳表达相关的MYB调控因子的结合位点。第三段为412碱基到548碱基处,全长137bp,该段区域含有1个生长周期相关调控信号位点和1个高表达量相关位点。3、从ugt79b1基因的启动子区5′端开始删除第一段,构建了含有第二段和第三段启动子区的GUS报告基因表达载体pBU23;删除启动子区第一段和第二段,构建了只含有第三段启动子区的GUS报告基因表达载体pBU3;以及含有全长548bp启动子区的GUS表达载体pBU123。采用花苞沾染法,分别将含这3个表达载体的农杆菌转化拟南芥,经过卡那霉素筛选和PCR验证,成功获得了转基因拟南芥。4、对转基因拟南芥中GUS报告基因的诱导表达进行分析。花青苷在拟南芥中是一种经诱导产生的次生代谢产物。因此为了让转入拟南芥中的启动子截短体能够发挥转录活性,需要对转基因拟南芥进行诱导处理。本工作采用脱落酸激素对转基因拟南芥幼苗进行诱导处理。脱落酸诱导后的转基因拟南芥幼苗中,pBU123质粒和pBU23质粒转化的拟南芥幼苗的叶片中GUS报告基因明显表达,活性分析表明其表达量也近似。而pBU3质粒转化的拟南芥幼苗叶片中GUS未表达。结果表明,当采用脱落酸诱导花青苷表达时,第212碱基到411碱基片段为ugt79b1启动子调控转录的核心区段。