肺炎链球菌（S.pneumoniae, S.pn）是一种条件致病菌，自然状态下就具有较高的转化率。在肺炎链球菌的进化、变异和致病过程中环境因素起着相当重要的作用，研究肺炎链球菌的致病机制必须考虑体内环境因素。怎样在体内真实的环境中去分析细菌毒力因子的作用是至关重要的。近几年作为活细胞探针的绿色荧光蛋白为我们提供了一种直观、简便、准确的体内研究手段。将绿色荧光蛋白与体内表达技术结合起来用于研究细菌毒力因子的表达，既可以分析细菌毒力基因的功能又可以筛选出未知的毒力基因。目的：构建肺炎链球菌自杀性荧光报告质粒，将肺炎链球菌溶血素基因与荧光报告基因融合，在体内环境中通过荧光的观察来分析溶血素的表达情况，为进一步研究肺炎链球菌毒力因子在活细胞内的定位和功能分析以及规模筛选毒力基因打下基础。方法：采用基因克隆技术，在肺炎链球菌自杀质粒pEVP3中插入融合基因ply-gfp。利用自杀质粒同源重组的原理，将重组自杀质粒整合入肺炎链球菌染色体中建立稳定的重组菌株。通过对绿色荧光蛋白的直接观察，在体内跟踪肺炎链球菌感染小鼠的过程以及肺炎链球菌溶血素的表达情况。结<WP=8>果：①成功构建了pEVP3-gfp质粒和pEVP3-ply-gfp质粒，建立了稳定重组gfp的肺炎链球菌菌株。②重组肺炎链球菌与未重组肺炎链球菌在生理活性上没有区别，荧光和溶血素均能正确表达，且荧光在细菌生长的对数后期表达较强。③动物实验表明荧光观察的结果与细菌培养的结果完全一致，同时证实溶血素在细菌自溶后释放到胞外产生毒力作用的活性。结论：利用自杀质粒同源重组的原理，将荧光报告基因融合入肺炎链球菌的染色体中，既可以实时定位观察肺炎链球菌在体内致病的分子过程，又可以通过荧光表达的差异来筛选毒力相关基因。