【摘 要】
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葡萄糖脱氢酶（Glucose Dehydrogenase,GDH）是一种广泛存在于多种生物体中的氧化还原酶,可用做血糖浓度的诊断用酶、生物燃料电池和生物传感器关键酶。GDH是生物体内磷酸戊糖代谢途径中一种重要的酶,特异性地催化D-葡萄糖生成β-D-葡萄糖酸内酯,同时将辅酶NAD（P）+还原成NAD（P）H。大部分氧化还原酶催化反应需要NAD（P）+辅酶的参与,辅酶NAD（P）+高价格极大限制了氧化
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葡萄糖脱氢酶（Glucose Dehydrogenase,GDH）是一种广泛存在于多种生物体中的氧化还原酶,可用做血糖浓度的诊断用酶、生物燃料电池和生物传感器关键酶。GDH是生物体内磷酸戊糖代谢途径中一种重要的酶,特异性地催化D-葡萄糖生成β-D-葡萄糖酸内酯,同时将辅酶NAD（P）+还原成NAD（P）H。大部分氧化还原酶催化反应需要NAD（P）+辅酶的参与,辅酶NAD（P）+高价格极大限制了氧化还原酶催化工业化应用。而通过辅酶再生是实现氧化还原酶催化反应的必需步骤,是解决氧化还原酶工业应用的有效方法。辅酶NAD（P）+/NAD+结构上相差一个磷酸基团,价格却相差7倍多。本研究以两种分别来源于巨大芽孢杆菌（B.megatherium）的葡萄糖脱氢酶（GlcDH和GDH223）为研究对象,通过对GDH结构分析和辅酶结合位点进行定点突变,建立了高效改变GDH辅酶偏好性的方法,获得对NADP+具有高酶活和偏好性的突变体,可以广泛应用于辅酶NADPH的再生。本论文的主要研究内容如下:1、通过对来源于B.megatherium IWG3的GlcDH结构分析和辅酶结合位点分析,选择与辅酶NAD（P）+分子中的2-磷酸和3’-羟基相结合的关键氨基酸位点（17位点苏氨酸）进行定点饱和突变。筛选到9个突变子与野生型相比对辅酶的活性和偏好性均有显著改变,其中突变体T17G对辅酶的偏好性由NAD+改变为NADP+。与野生型GlcDH相比,突变体T17G对辅酶NADP+的活性提高了 15.4%,对辅酶NAD+的活性降低了 25%。T17G对辅酶NADP+的Km较野生型相比提高了 1.71倍,对辅酶NADP+偏好性提高了 11倍。同时对突变体T17G与辅酶对接分析表明,GlcDH的17位点Thr→Gly可以提高其对辅酶NADP+的结合能力,证明通过对GlcDH的17位点进行定点突变,可以有效改变GlcDH的辅酶偏好性。2、通过多序列比对和结构分析表明,葡萄糖脱氢酶家族的17位点氨基酸均位于辅酶结合保守区域（GXXXGXG）,是与辅酶NAD（P）+分子2-磷酸和3’-羟基结合的关键位点。在此基础上我们提出通过对葡萄糖脱氢酶的辅酶识别区域进行序列比对和结构分析确定突变位点,通过对17位点进行定点突变来改变GDH辅酶酶活和偏好性的策略。以来源于B.megatherium AS223的GDH233作为研究对象验证方法的可行性,对GDH223的17位点Lysine进行定点突变,分别将其突变为中性和酸性氨基酸并成功构建了三个单突变体GDH223 K17G、K17D和K17T,与野生酶相比,三个突变体对辅酶NAD+/NADP+的活性和偏好性均有显著提高。其中GDH223-K17T对辅酶NAD+和NADP+的酶活分别提高了 280.4%和99.2%。GDH223-K17D突变体对NADP+的偏好性提高了 1.94倍。酶学性质研究表明野生型和突变体的最适温度均为50℃,最适pH为7.0。对GlcDH和GDH223的17位点定点突变结果证明,我们提出的针对葡萄糖脱氢酶17位点进行定点突变改变酶活以及辅酶偏好性的策略,可以有效应用于葡萄糖脱氢酶家族辅酶偏好性改变。3、在此基础上针对GDH223辅酶结合保守区域（GXXXGXG）相邻16位点氨基酸进行迭代突变以期获得更高酶活和偏好性的突变体。试验以突变体GDH223 K17D为模板,采用定点突变的方法对相邻的16位点进行迭代突变,成功构建突变体S16K/K17D和S16E/K17D。迭代突变体S16K/K17D对NADP+的酶活提高了 27.51%,迭代突变体S16K/K17D对辅酶NADP+的偏好性改变了2.61倍。突变酶的最适温度为50℃,最适pH为7.0。总之,本论文提出通过对葡萄糖脱氢酶系辅酶结合位点保守区域进行多序列比对和蛋白质三维结构分析,确定17位点是对辅酶活性和偏好性改变关键位点,通过定点突变快速高效改变辅酶偏好性的策略。分别对GlcDH和GDH223的17位点进行定点突变,均可快速改变辅酶活性和偏好性。该策略无需建立大量的突变文库和高通量筛选,即可简单高效改变葡萄糖脱氢酶家族辅酶酶活和偏好性。
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