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第一部分轻型链球菌对铜绿假单胞菌BF致病性的影响目的:机械通气广泛应用及生物膜(BF)在气管导管(ETT)的形成,新生儿呼吸机相关肺炎(VAP)仍然是临床上的棘手问题。我们前期发现铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和轻型链球菌(S.mitis),一种口咽部正常细菌,在新生儿ETT表面最常见;且S.mitis检出率在VAP组患儿中较高。鉴于BF内的不同种细菌可能促进或抑制对方,本研究目的在于探讨S.mitis能否影响P.aeruginosa的致病性。方法:将BF培养分为PAO1组、S.mitis组和PAO1+S.mitis组,并收集生物膜培养液(BCM)。结晶紫、平板计数以及光学显微镜观察细菌粘附能力。结晶紫、平板计数、CCK-8及激光共聚焦(CLSM)观察BF形成。BCM刺激人气道上皮细胞(BEAS-2B)后,检测细胞活性、IL-8表达以及TLR2、4的表达。结果:结果显示S.mitis几乎不能粘附于非生物介质表面,且不能形成BF,但它增强了PAO1的粘附能力和BF形成(P<0.05)。混合BF内总活菌数和活P.aeruginosa数明显高于PAO1单独组(P<0.05)。然而,与PAO1单独组BCM相比较,混合BCM的细胞毒性及其诱导的IL-8,TLR2、4表达明显降低(P<0.05)。结论:S.mitis作为传统观点认为的口咽部正常细菌,一方面它能增强PAO1粘附力及BF形成,从而逃避宿主免疫及抗生素杀伤;另一方面S.mitis减轻了PAO1诱导的宿主免疫反应。可能是新生VAP患儿ETT BF表面S.mitis检出率高的原因。研究结果提示我们不能忽视传统观点认为的非致病菌在BF中的作用。对于新生儿VAP ETT表面BF致病机制提供了新的思路,该观点亦可能为其他BF相关感染提供新研究方向。第二部分轻型链球菌对浮游铜绿假单胞菌致病性的影响目的:第一部分已证实S.mitis能增强PAO1粘附力、BF形成能力,并减轻PAO1 BCM诱导的细胞毒性和免疫反应。BF成熟后亦可释放浮游细菌,对宿主产生影响。且研究表明某些口腔常驻菌群(如牙卟啉单胞菌、放线菌等)能促进某些呼吸道病原体对于宿主细胞及组织的粘附等,从而影响其致病性。那么S.mitis对于浮游状态的P.aeruginosa有无作用呢?这是本部分实验拟阐明的问题。方法:将浮游菌分组为PAO1组、S.mitis组和PAO1+S.mitis组。将细菌(MOI=100)加入人呼吸道上皮细胞(BEAS-2B)。侵袭实验和粘附实验观察细菌对BEAS-2B细胞的侵袭和粘附力。CCK-8法检测细胞存活率,ELISA法检测细胞IL-8表达。结果:与PAO1单独组相比较,S.mitis可促进PAO1对BEAS-2B的侵袭能力(P<0.05),而对PAO1粘附BEAS-2B的能力无明显影响(P>0.05)。PAO1+S.mitis组与PAO1单独组在细胞存活率及IL-8水平无显著差异(P>0.05)。结论:S.mitis能增强PAO1对BEAS-2B细胞侵袭性,但对PAO1粘附BEAS-2B细胞无影响,提示两者机制不同。虽然在S.mitis存在下,浮游PAO1侵袭性增强,但细胞存活率及炎症无显著影响,这可能利于PAO1在宿主细胞内形成BF,逃逸宿主免疫。S.mitis对PAO1致病性的影响可能主要在其BF状态产生。第三部分轻型链球菌通过增强铜绿假单胞菌生物膜QS系统促进其生物膜形成目的:多菌种BF内部菌群间交流调控机制是BF形成的关键环节,其中密度感应(Quorum sensing,QS)系统是研究多菌种BF调控的关键。第一部分已证实S.mitis能增强PAO1粘附力、BF形成能力,但具体机制不明;而P.aeruginosa的QS系统与其粘附力、BF形成能力密切相关。那么,S.mitis对P.aeruginosa上述能力的促进作用是否与其作用于P.aeruginosa的QS系统相关呢?方法:BF分为PAO1组、P.aΔlas R组、P.aΔLas RΔrhl R组、S.mitis组、PAO1+S.mitis组、P.aΔlas R+S.mitis组、P.aΔLas RΔrhl R+S.mitis组。结晶紫、平板计数法以及光学显微镜观察细菌粘附能力。结晶紫、平板计数及激光共聚焦(CLSM)观察BF形成。q PCR法检测各组BF的QS基因表达(包括las I、las R、rhl I、rhl R)。结果:PAO1+S.mitis、P.aΔlas R+S.mitis、P.aΔLas RΔrhl R+S.mitis三个组的粘附力均分别明显强于单独PAO1、P.aΔlas R和P.aΔLas RΔrhl R组(P<0.05);且平板计数法结果显示PAO1+S.mitis、P.aΔlas R+S.mitis、P.aΔLas RΔrhl R+S.mitis混合组中粘附的P.aeruginosa菌分别较单独PAO1、P.aΔlas R、P.aΔlas RΔrhl R组多(P<0.05)。PAO1+S.mitis混合组的BF生物量明显多于PAO1单独组(P<0.05);然而,P.aΔlas R+S.mitis组和P.aΔLas RΔrhl R+S.mitis组BF生物量与P.aΔlas R组、P.aΔLas RΔrhl R组BF生物量无明显差异(P>0.05)。S.mitis能上调PAO1菌株的QS基因表达(包括las I、las R、rhl I、rhl R),明显高于单独PAO1组的表达(P<0.05);然而P.aΔlas R+S.mitis组和P.aΔLas RΔrhl R+S.mitis组的QS基因表达(包括las I、las R、rhl I、rhl R)并无上调,与单独P.aΔlas R和P.aΔlas RΔrhl R组无差异(P>0.05)。结论:S.mitis对于P.aeruginosa粘附力的促进不依赖于QS系统,有其他机制参与。S.mitis通过上调P.aeruginosa QS基因促进其BF形成。这种促进机制是通过S.mitis直接作用还是其分泌某些物质(如AI-2)对P.aeruginosa BF形成起作用待未来实验论证。