靶向于血小板源性生长因子受体β的干扰素-γ脂质体对大鼠肝纤维化治疗作用的研究肝纤维化是慢性肝病重要病理特征,是发展到肝硬化的必经阶段。尽管迄今为止国内外的研究就肝纤维化和早期肝硬化可以逆转,已有共识,并在抑制肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)活化并促进其凋亡、调节细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的合成和降解等方面取得一些成果,对肝纤维化的临床治疗提供了一些药物和方法,但总体疗效仍不理想。目前多认为,限制临床上应用的抗肝纤维化药物效果的原因,可能与药物无法达到靶细胞、或到达靶细胞但无法在其周围形成有效的药物浓度及半衰期短和药物对其他组织细胞的副作用大过增加剂量带来的疗效等有关。通过靶向载药系统转运药物,可达到靶向、长循环进而增加疗效及减少抗肝纤维化药物的全身副作用的目的。这里主要涉及：①靶向头基的选择；②载体形式的选择；③抗肝纤维化药物的选择。鉴于HSC激活是肝纤维化发展过程中的中心事件,因此,HSC是抗肝纤维化治疗的首选靶细胞。在HSC上,尤其是激活的HSC上特殊表达或过量表达的受体,是最经常被靶向载药系统采用的靶点。血小板源性生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)是肝纤维化形成过程中最强的促增殖因子,与转化生长因子β1(transform growth factorβ1, TGF-β1)在肝纤维化的形成中起着重要作用；而且PDGF受体β(PDGF receptorβ, PDGFR-β)己被广泛的证明在激活的HSC上优势过量表达。近年来已有研究证明,环肽C*SRNLIDC* (pPB)能特异性识别PDGFR-β。与其他非多肽、非脂质体的靶向载药系统相比,小分子多肽作为靶向头基具有化学结构明确,高纯度并可被大量制备的优点；脂质体作为载体具有安全、载药谱广的优点。此外,立体稳定脂质体(sterically stabilized liposome, SSL)的聚乙二醇化(polyethylene glycol conjugated, PEGlated)的设计和能够达到纳米粒级别(<100nm)的粒径,能够使它规避网状内皮系统的吞噬,更具有长循环的特点。干扰素-γ(IFN-γ)是目前已经被批准临床应用的抗肝纤维化作用药物,在许多体内外实验中表现出一定的抗肝纤维化作用,但在临床应用中IFN-γ表现出相对低的疗效、相对短的半衰期和一些严重的副作用,如发热、血细胞减少、肝功能损害加重等,严重制约着IFN-γ的临床应用。本研究中,我们在国内外率先设计了针对PDGFR-β的环肽(pPB)修饰的包封IFN-γ的立体稳定脂质体(pPB-SSL-IFN-γ),并通过体内外的实验研究,从分子、细胞和器官的水平探讨这个主动靶向载药系统能否解决IFN-γ的疗效低、半衰期短、副作用多的临床问题,并对其作用机制进行更深入的探讨,寻求更可能为临床所用的抗肝纤维化的靶向药物治疗途径,为进一步可能的临床研究提供理论依据,以期最终能使病人受益。本研究的主要内容包括：①环肽和靶向IFN-γ脂质体的制备和表征；②原代大鼠肝星状细胞的分离、培养和鉴定；③环肽和靶向脂质体对肝星状细胞的靶向性验证；④靶向IFN-γ脂质体对肝星状细胞的体外抗肝纤维化作用的研究；⑤靶向IFN-γ脂质体在正常大鼠体内的药代动力学和体内分布的研究,以及靶向IFN-γ脂质体在肝纤维化大鼠的体内分布和肝组织上细胞定位的研究；⑥靶向IFN-γ脂质体对大鼠肝纤维的体内抗肝纤维化作用和改善副作用的研究。第一部分环肽和IFN-γ靶向脂质体的制备和表征目的：人工合成C*SRNLIDC*环肽(pPB),并表征。构建pPB介导的IFN-γ主动靶向脂质体(pPB-SSL-IFN-γ),并表征其特性。方法：采用固相合成的方法合成pPB,并冻干低温保存,以高效液相分析pPB的纯度,以质谱法检测其分子量。为制备靶向脂质体pPB-SSL-IFN-γ,将胆固醇：蛋磷脂酰胆碱：甲氧基-聚乙二醇2000-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-DSPE):马来酰亚胺-聚乙二醇3400-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺(mal-PEG+3400-DSPE)以2：1：0.1：0.02的摩尔比溶于氯仿,根据水化液不同,采用旋转蒸发-薄膜水化-挤压法制备各种非靶向脂质体。为了制备pPB介导的靶向脂质体,先将pPB与SATP反应,给pPB引入巯基,得到pPB-SH，并质谱验证其分子量,后将pPB-SH与非靶向脂质体反应,得各种靶向脂质体,进一步利用氢谱(1H-NMR)验证pPB-SH与非靶向脂质体膜材料中含有的mal-PEG3400-DSPE的结合。从粒径、包封率、载药量、稳定性等方面表征其理化特性。结果：合成的pP、pPB-FITC和pPB-SH纯度>95%,质谱检测它们的分子量符合理论值,提示合成正确。进一步通过对比,在mal-PEG3400-DSPE的1H-NMR上清楚显示mal峰,在pPB-PEG3400-DSPE的1H-NMR上消失,提示了pPB与靶向脂质体膜材料mal-PEG3400-DSPE中mal基团通过加成反应相连。制备的pPB-SSL-IFN-γ的平均粒径为83.5nm,多分散指数(PI)为0.067；包封率为32.73±4.61%;载药量为8.99×104IU/μmol磷脂；4℃冷藏情况下,1月后无明显变化,稳定性良好；3月后粒径增大、分布增宽和包封率下降,提示脂质体颗粒有融合、粒径变大和IFN-γ的泄漏。结论：固相合成法可大量、高纯度合成pPB。成功制备了下一步实验需要的纳米级别的pPB介导的IFN-γ的靶向脂质体。第二部分原代大鼠肝星状细胞的分离、培养和鉴定目的：探讨原代大鼠肝星状细胞的分离、培养方法,并鉴定。为进一步的体外实验提供理想的细胞模型。方法：采用胶原酶离体灌流、Nycodenz为分离介质的密度梯度离心的方法分离大鼠的肝星状细胞,并培养传代及同步鉴定。结果：每只大鼠肝星状细胞的得率可达2-5x107/只,细胞存活率>90%。培养过程中出现特征性形态变化,进一步细胞免疫荧光化学鉴定；培养4d,Desmin染色阳性,提示得到的为肝星状细胞；培养10d和传1代后,α-SMA染色阳性,提示为活化表型。结论：成功获得进一步实验所需的理想细胞模型---原代大鼠活化的肝星状细胞。第三部分环肽和靶向脂质体对肝星状细胞的靶向性目的：探讨pPB环肽和pPB介导的靶向脂质体与原代活化的大鼠肝星状细胞和人肝星状细胞株LX-2体外结合的特性和细胞内定位的情况。方法：合成异硫氰荧光素(FITC)标记的环肽(pPB-FITC),制备包封FITC的靶向(pPB-SSL-FITC)和非靶向脂质体(SSL-FITC).通过流式细胞仪测定pPB-FITC与原代活化的大鼠肝星状细胞和人LX-2细胞株结合的荧光强度,实施结合-饱和实验和结合-竞争实验,并比较pPB-SSL-FITC和SSL-FITC与原代大鼠肝星状细胞的结合能力。通过荧光显微镜及激光共聚焦显微镜观察pPB-FITC和pPB-SSL-FITC在活化的大鼠肝星状细胞内的定位。结果：pPB-FITC与原代活化的大鼠肝星状细胞和人LX-2肝星状细胞株的结合具有饱和性和浓度依赖性；未标记的pPB对pPB-FITC与原代活化大鼠肝星状细胞和LX-2细胞株的结合有竞争抑制作用,且呈浓度依赖性。靶向脂质体pPB-SSL-FITC与原代大鼠活化的肝星状细胞结合的能力是非靶向脂质体SSL-FITC的3.01±1.50倍。原代大鼠活化的肝星状细胞能内吞pPB-FITC和pPB-SSL-FITC,绿色荧光信号主要分布于胞浆。结论：pPB与原代大鼠肝星状细胞和人LX-2肝星状细胞株以受体介导的方式特异结合。靶向脂质体与活化的大鼠肝星状细胞结合的能力明显高于非靶向脂质体,结合后靶向脂质体被肝星状细胞内摄,主要分布在细胞浆,提示pPB-SSL可以作为靶向于HSC的载体来载送相关的药物。第四部分IFN-γ靶向脂质体对大鼠肝星状细胞的作用目的：考察pPB介导的IFN-γ靶向脂质体对活化的大鼠肝星状细胞的体外药效及作用机制。方法：通过Alamar blue分析法检测IFN-γ脂质体对细胞增殖的影响；通过Hoechst33258和TUNEL的方法检测IFN-γ脂质体对细胞凋亡的影响；通过Western blot分析的方法检测IFN-γ脂质体对细胞α-平滑肌肌动蛋白(α—SMA)表达的影响。结果：含有相同IFN-γ剂量的靶向IFN-γ脂质体与IFN-γ非靶向脂质体和游离IFN-γ相比,明显抑制活化的肝星状细胞的增殖；Honchst33258和TUNEL染色发现,IFN-γ靶向脂质体明显抑制活化肝星状细胞的凋亡；Western blot分析法证实,IFN-γ靶向脂质体能明显抑制活化肝星状细胞的α-SMA的蛋白表达。结论：与游离IFN-γ和非靶向IFN-γ脂质体相比,IFN-γ革巴向脂质体能更有效的抑制活化大鼠肝星状细胞的增殖、凋亡和α-SMA的表达。第五部分IFN-γ靶向脂质体在大鼠体内的药代动力学、组织分布和细胞定位目的：探讨IFN-γ靶向脂质体在正常大鼠体内的药代动力学和组织分布的规律,并探讨IFN-γ非靶向脂质体(SSL-IFN-γ)和IFN-γ靶向脂质体(pPB-SSL-IFN-γ)在肝纤维化大鼠体内的动态分布和肝组织上的细胞定位情况。方法：采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测pPB-SSL-IFN-γ和游离IFN-γ静脉注入正常大鼠体内5mi n-24h不同时间点的血浆样本中IFN-γ的浓度,并比较两者的半衰期(t1/2)；进一步通过24h时获得的大鼠的不同组织中IFN-γ的浓度,观察其组织分布情况。制备包含DIR(一种近红外染料)的靶向和非靶向脂质体,采用荧光活体成像仪比较IFN-γ靶向脂质体(DIR-pPB-SSL-IFN-γ)和IFN-γ非靶向脂质体(DIR-SSL-IFN-γ)在正常大鼠和纤维化大鼠体内分布的动态显像的情况。采用双重荧光标记免疫组化染色法,考察靶向和非靶向脂质体携带的IFN-γ在纤维化大鼠肝组织内的细胞定位情况。结果：药代动力学研究显示：pPB介导的靶向IFN-γ脂质体的半衰期(t1/2)和曲线下面积(AUC)明显长于游离IFN-γ。组织分布研究显示：pPB介导的靶向脂质体运载的IFN-γ在体内主要聚集在肝组织内；而游离IFN-γ在体内主要分布在肝组织和肠；进一步比较在同一种脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑和肠)内的分布,pPB介导的靶向脂质体载送的IFN-γ较游离IFN-γ明显增多。活体荧光动态成像显示：①正常大鼠体内：DIR-SSL-IFN-γ和DIR-pPB-SSL-IF-γ在注射后1h,肝脏区域的荧光强度明显增加至最高,后强度逐渐下降直至48h,其它脏器才可看见荧光分布；在成像48h的时间点,结束活体成像,取心、肝、脾、肺、肾和血液组织,立即于体外成像显示：肝组织的荧光强度明显高于其他组织,血液标本的荧光强度甚至接近0,进一步证明了活体成像中肝脏区域的荧光图象确为肝组织中荧光显像,并显示了直至48h,肝组织仍明显的荧光聚集。②纤维化大鼠体内：DIR-pPB-SSL-IFN-γ注入纤维化大鼠体内2h时,肝脏区域的荧光强度已经明显高于DIR-SSL-IFN-γ注入组；至20h时,这种趋势更加明显,甚至在DIR-SSL-IFN-γ处理组的肝脏区域的荧光强度显示出较2h时下降,而DIR-pPB-SSL-IFN-γ处理组大鼠肝脏区域的荧光强度较2h时明显增加。双重荧光标记免疫组织化学染色探测细胞定位的研究显示：DPB-SSL携带的IFN-γ在肝组织中与α-SMA的共同表达率(60.13±9.15%)明显高于SSL携带的IFN-γ(12.11±3.26%)(n=3,p<0.01),且图像显示后者主要定位于肝细胞。结论：与游离IFN-γ相比,pPB介导的靶向脂质体携带的IFN-γ在体内的药代动力学和组织分布的研究显示了长循环的特性；IFN-γ靶向和IFN-γ非靶向脂质体均显示了明显的肝组织的器官靶向特性,但IFN-γ靶向脂质体在肝纤维化大鼠体内显示出更加明显的肝脏器官靶向。在纤维化肝组织中靶向脂质体携带的IFN-γ主要定位于肝星状细胞；而非靶向脂质体携带的IFN-γ主要定位在肝细胞,验证了靶向脂质体载送的IFN-γ在纤维化大鼠肝组织内的HSC细胞靶向性。第六部分IFN-γ靶向脂质体对大鼠肝纤维化的体内抗肝纤维化作用和改善副作用的研究目的：研究IFN-γ靶向脂质体对大鼠肝纤维化的体内抗肝纤维化作用,并观察其对改善某些副作用的效果。方法：将40只肝纤维化大鼠,随机分成6组,分别给与(均尾静脉注射,2次/周,持续4周)：①PBS(n=4);②空白脂质体pPB-SSL(n=4)；③IFN-γ(n=8)；④IFN-γ非靶向脂质体(n=8)；⑤IFN-γ靶向脂质体(n=8)；⑥5倍剂量IFN-γ组(n=7),其中①作为模型对照组(model control group)；②作为空白pPB-SSL对照组；③④⑤此3种制剂中游离IFN-γ含量均为2x105IU/m1；⑥中游离的IFN-γ含量为1x10.IU/m1。6只正常大鼠在同等的条件下被饲养,作为正常对照组(normal control group)。最后一次静脉注射后48h,收集大鼠的血液标本,分别检测肝功能(ALT、AST和ALB)、血液分析(WBC、HGB和PLT)和血清肝纤维化指标(HA和IV-C)；收集肝组织标本,分别进行HE、MassOn胶原三色染色、羟脯氨酸含量测定、Ⅰ型胶原的免疫组织化学染色和肝组织的α-SMA蛋白表达的western blOt分析。结果：与模型对照组、游离IFN-γ组甚至IFN-γ非靶向脂质体组和5倍剂量游离IFN-γ组相比,IFN-γ靶向脂质体明显减轻大鼠的肝纤维化分期,并明显减少肝组织Ⅰ型胶原染色面积、血清IV-C水平和肝组织α-SMA蛋白的表达；与模型对照组和游离IFN-γ低剂量组相比,IFN-γ靶向脂质体明显改善由于肝纤维化造成的HGB和PLT的减少,还可明显降低肝组织羟脯氨酸含量；与模型对照组相比,IFN-γ靶向脂质体亦明显降低肝纤维化大鼠血清ALT和HA水平；与模型对照组和游离IFN-γ高剂量组相比,IFN-γ靶向脂质体亦明显减轻肝纤维化大鼠的肝脏病理炎症HAI分级。同时,IFN-γ靶向脂质体治疗组的血清AST水平较IFN-γ非靶向治疗组明显降低(P<0.05)；而且IFN-γ靶向脂质体治疗组的WBC计数高于游离IFN-γ的低剂量组和高剂量组(P=0.072和P=0.070)。结论：IFN-γ靶向脂质体显示出更加明显的体内抗肝纤维化作用,而且,IFN-γ靶向脂质体能够明显改善IFN-γ非靶向脂质体非选择性肝细胞摄取造成的AST的升高和避免高剂量IFN-γ造成的肝脏炎症坏死程度加重。另外,IFN-γ靶向脂质体可在一定程度上改善游离IFN-γ造成的血WBC计数的降低。