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背景与目的现阶段,癌症已经成为一种严重威胁人类健康的疾病。环境恶化、工作压力增加等因素使得癌症的发病率和死亡率逐年增长;其中,肺癌高居肿瘤发病率和死亡率首位。肺癌的治疗主要面临肿瘤耐药性和毒副作用等问题,肺癌肿瘤耐药问题的出现导致肺癌药物治疗的效果大大减弱,患者生存率降低。近年来,针对肿瘤耐药性的药物一直是抗肿瘤药物研发的热点。由于天然产物抗肿瘤效果好、毒副作用相对较小等优点,逐渐成为抗肿瘤药物研发的热点方向,而且有希望解决耐药性肿瘤的治疗问题。马利筋是一种多年生草本植物,属于萝藦科。原产于南美洲,后用于园林绿化被广泛引进种植,其茎基部半木质化,直立性,全株有毒,尤以乳汁毒性较强,含强心苷,可作为药用。马利筋入药具有清热解毒、活血止血、消肿止痛之功效;西方部族常用马利筋来治疗痔疮、淋病、蛔虫感染以及腹部肿瘤等疾病。鉴于马利筋的药用价值,本课题组对马利筋包含的成分进行了分离鉴定,发现其提取物包括强心苷、萜类等有生物活性的成分;其中强心苷类化合物又是其主要构成成分。强心苷类临床上主要用以增强心肌收缩力,治疗慢性心功能不全。现阶段有研究发现,一些强心苷类化合物具有对肿瘤细胞抑制的作用。本课题组在前期实验中对分离提取的强心苷类马利筋提取物进行了抗肿瘤活性筛选,并发现化合物M11在体外具有对肿瘤细胞抑制增殖的作用。本课题基于目前临床肺癌顺铂治疗耐受性(抗药性)问题,着重筛选开发具有选择性杀伤具有顺铂耐药表型非小细胞肺癌细胞A549/CDDP的候选化合物,本研究在此基础上对M11是否具有选择性抗肿瘤的作用和机制进行了探究。本研究主要从化合物M11体外抗肿瘤活性、对耐顺铂非小细胞肺癌A549/CDDP增殖抑制的作用以及机制几方面进行探究。该研究将为化合物M11的后续开发以及同类化合物抗肿瘤作用机制的研究提供一些理论参考。研究方法1.M11体外抗肿瘤活性的研究:考察M11对非小细胞肺癌细胞株(A549,A549/CDDP)、肝癌细胞株(Hep G-2,Hep G-2/ADR)、乳腺癌细胞株(MCF-7,MCF-7/ADR)的抗肿瘤活性;采用MTT法进行检测,并计算出不同时间的IC50。利用MTT法考察48 h M11对NIH3T3、H9C2、HEK-293、RAW246.7几种非肿瘤细胞的细胞毒性,并计算其IC50。2.采用流式细胞术法检测M11对A549、A549/CDDP细胞的细胞周期的影响。进一步利用荧光显微镜检测M11对A549,A549/CDDP细胞形态的影响,考察细胞形态是否发生改变;再利用流式细胞术检测是否有凋亡发生。3.利用免疫荧光、western blotting技术检测自噬相关标志物自噬小体、LC3、Beclin-1蛋白的表达,确认是否M11在低浓度(0.01,0.05μM)刺激会诱导A549/CDDP细胞发生自噬现象。4.M11体外抗非小细胞肺癌机制的初步探究:利用western blotting技术检测A549/CDDP细胞相关周期调控因子cyclins、CDKs、CDKIs的表达水平,并检测凋亡相关调控因子caspase家族、bcl-2家族、PARP等蛋白以及线粒体活性的变化。进一步利用流式细胞术检测JNK特异性抑制剂处理后,A549/CDDP细胞凋亡发生率的改变状况,并检测JNK、caspase的表达是否协同变化,对凋亡机制进行初步探究。研究结果1.通过MTT法进行M11抗肿瘤活性考察,发现M11对A549/CDDP细胞具有最为敏感的选择性增殖抑制作用,48 h IC50为0.33μM;M11相同条件下对其野生型细胞A549增殖抑制作用则不明显,IC50为38.46μM。考察M11对NIH3T3、H9C2、HEK 293、RAW 246.7几种非肿瘤细胞的细胞毒性,48 h其IC50分别为48.42μM、58.79μM、1.86μM、28.07μM。2.M11处理A549、A549/CDDP细胞通过流式细胞术检测发现:A549/CDDP细胞在M11处理时随着浓度递增发生明显的G2/M期阻滞,相同实验条件下,A549细胞中则无明显的阻滞现象发生。细胞形态学荧光结果显示:M11处理会导致部分A549/CDDP细胞核皱缩、胞浆线粒体活性降低。流式细胞术检测A549/CDDP细胞在M11 0.5μM、1μM时有明显的凋亡发生;相同实验条件下,A549中无明显凋亡现象。3.MDC染色显示M11浓度为0.01,0.1μM作用A549/CDDP细胞时,细胞内有明显的酸性液泡聚集。进一步检测LC3、Beclin-1蛋白表达,发现LC3、Beclin-1被活化,现象提示可能有自噬发生。4.初步的机制研究发现,在A549/CDDP细胞中,检测G2/M期相关调控蛋白:cyclin A/B均被下调,CDK1、CDK2也一致被下调,p21、p53则表达上调;在A549细胞中,相关调控因子没有明显的上调或者下调。A549/CDDP细胞中,凋亡相关调控因子caspase家族、bcl-2家族以及PARP等蛋白被活化,线粒体活性明显降低;探究其上游靶点发现,JNK被活化,使用特异性抑制剂后凋亡率明显降低且相关活化状态caspase-3,9均呈现协同性下调变化。研究结论1.M11实验条件下对耐顺铂非小细胞肺癌A549/CDDP细胞具有选择性增殖抑制作用,而对其野生型肺癌细胞A549则无明显的增殖影响。2.根据IC50<10μM时认为具有抗肿瘤活性的原则;M11体外对耐顺铂非小细胞肺癌A549/CDDP细胞具有选择性抗肿瘤活性,而对其野生型肺癌细胞A549则无抗肿瘤活性。3.A549/CDDP在低浓度(n M)M11干预下,能够通过激活细胞内自噬代偿性保护系统,避免细胞发生M11介导的凋亡。4.在机制方面,M11能够通过上调p53、p21蛋白抑制CDK1/cyclin B1、CDK2/cyclin A复合物等周期调控因子诱导A549/CDDP细胞发生G2/M期的周期阻滞。M11也可以激活A549/CDDP细胞内JNK通路调节bcl-2蛋白诱导A549/CDDP细胞发生线粒体通路凋亡。