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家蚕脂肪酶Bmlipase-1是一种消化酶,其主要生理功能是消化水解脂类与脂蛋白;然而Bmlipase-1可以在BmNPV感染的起始阶段,抑制病毒的扩增,保护中肠上皮组织细胞免受BmNPV-ODV的感染。Bmlipase-1具有中肠组织表达特异性,在蚕体第一道免疫防线中发挥抵抗病毒的作用。本文对Bmlipase-1启动子调控区进行了分析研究,为筛选获得可用于转基因家蚕研究的特异性启动子提供了基础信息,同时也有利于进一步阐明Bmlipase-1的转录调控机理;此外,检测了Bmlipase-1在不同家蚕品系幼虫中肠组织的转录表达水平,探究了Bmlipase-1的表达与家蚕对BmNPV的抗性之间的关系。本研究主要包括以下两部分内容: 1、从家蚕基因组DNA中克隆了Bmlipase-1启动子调控序列,测序鉴定后进行生物信息学分析。根据软件预测结果,PCR克隆获得系列缺失不同元件的启动子片段,以EGFP作为报告基因,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建含有上述启动子片段的报告质粒;用重组杆状病毒转染细胞,并体腔注射家蚕,通过荧光观察、荧光定量PCR和ELISA检测,在转录水平和翻译水平对报告基因的表达量进行了检测。 所克隆序列涵盖Bmlipase-1的第1外显子(1～52)、第1内含子(53～935)、核心启动子区(-100～-1)和5’上游区(-1980～-101)四部分,转录起始位点紧邻区域内未预测到可识别的TATA盒。根据报告基因的表达量高低,不同长度启动子片段的活性趋势为:-1453～192区最高,-1453～955区和-678～192区第二,-678～955区第三,-383～955区和-81～955区第四,-1980～955区和494～955区最低。由此推测:-1453～-679区,-678～-384区和-81～493区可能存在正调控启动元件,其中-1453～-679区的正调控作用最强,-678～-384区居中,-81～493区较弱;-1980～-1454区和193～955区可能存在负调控元件;-383～-82区的调控作用不显著。其中,-1453～-679区含有家蚕中肠组织特异性相关基因启动子保守序列,同时包含1个CAAT盒和大量GATA序列,推测该区域可能与Bmlipase-1的组织表达特异性相关;-81～493区含有核心启动子区、第1外显子和部分第1内含子序列,同时包含大量Pbx-1结合位点、OTC序列和GATA序列,推测该区域对于Bmlipase-1的转录调控具有基础作用。 2、以具有不同BmNPV抗性水平的6个家蚕品系为材料,利用实时定量PCR(qRT-PCR)技术,检测Bmlipase-1在不同品系健康幼虫中肠组织的表达水平及感染BmNPV后幼虫中肠组织中该基因的表达水平,探究该基因表达与家蚕对BmNPV的抗性之间的关系。 一方面,不同家蚕品系间Bmlipase-1的表达水平差异显著,抗性较强的品系,其表达水平较高,供试品系中NIL·LVR的Bmlipase-1表达水平最高,p50、CVDAR18、nsd·NIL依次降低,892和306最低。NIL·LVR品系5龄期Bmlipase-1的平均表达量约为306品系的8.2倍。另一方面,BmNPV能够诱导Bmlipase-1的表达,但不同品系间该基因的诱导表达差异显著,抗性较强的品系,其诱导表达水平相对较高,供试品系中NIL·LVR的Bmlipase-1诱导表达水平最高,p50其次,CVDAR18和nsd·NIL第三,892和306最低。NIL·LVR品系经BmNPV感染诱导后Bmlipase-1的5龄期平均表达量约为306品系的12.4倍。推测Bmlipase-1的表达水平与蚕体自身的BmNPV抗性有一定的关联性。