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目的:
建立近平滑念珠菌弥散性感染小鼠模型,通过在成模过程中的不同阶段,进行病理组织学检测、血常规分析、动态载菌量分析、肾组织的细胞因子检测及外周血细胞Th1/Th2比例分析,探讨小鼠染菌后病变发展过程及临床特征变化与临床各实验指标之间的关系,为深入研究真菌感染疾病发生发展的免疫机制及为近平滑念珠菌的药物开发提供相关的实验依据。
方法:
1.近平滑念珠菌的培养及质控
2.小鼠的免疫抑制:
本实验选取SPF级ICR小鼠。小鼠腹腔注射CY,100mg/kg,次/24hr,注射3次。使小鼠血常规外周血白细胞总数降至1.0x106/ml左右,为免疫抑制形成的决定性指标。
3.造模方法:
ICR小鼠连续腹腔注射CY 3天后,接种酵母型CP(Candida parapsilosis)。高剂量组小鼠接种菌浓为1.6x106个/ml,低剂量组小鼠接种菌浓为1.0×103个/ml,尾静脉注射100μl/只。CY组小鼠尾静脉注射生理盐水100μl/只.每天观察两次,连续观察19天。
4.模型的检测指标:
4.1生存曲线
4.2临床表征
4.3血常规指标检测
4.4病理组织学检测
4.5靶器官动态载菌量检测
4.6肾组织的细胞因子检测
4.7外周血Th1/Th2检测
结果:
1.近平滑念珠菌的培养及菌型控制:
近平滑念珠菌体外两次复转后,收集菌体,通过台盼蓝染色镜检,90%以上菌体为活菌体,通过甲苯胺蓝染色镜检,菌体形态为均匀透明或半透明椭圆形浅蓝色酵母型菌体。
2.小鼠的免疫抑制:
实验小鼠注射CY后第1天(即-2天)开始出现外周血白细胞总数的下降,于连续注射3天后,第4天~第5天(即0天或第1天)小鼠外周血白细胞总数下降至最低点,外周血白细胞总数维持在1.0×109/L左右,确定为小鼠免疫抑制最佳状态。
3.建立近平滑念珠菌弥散性感染小鼠模型:
3.1造模方法:ICR小鼠连续腹腔注射CY 3天后,接种酵母型CP(Candidaparapsilosis)。高剂量组小鼠接种菌浓为1.6×106个/ml,在染菌后第2天出现死亡,8天内全部死亡,出现肾、脑等多器官弥散性真菌感染;低剂量组小鼠接种菌浓为1×103个/ml,观察至19天,仅出现死亡小鼠2只.
3.2模型指标:
3.2.1生存曲线:高剂量感染组小鼠接种1.6×106个/ml CP,染菌后的第2天出现死亡,8天内全部死亡,平均生存时间为4.56天;低剂量感染组小鼠接种1×103个/ml CP,染菌后8天内小鼠死亡2只,观察至19天动物未见死亡,死亡率为5%。
3.2.2临床表现:
(1)高剂量感染组小鼠在染菌后第1天,即开始出现明显的精神不振,行动迟缓,卷缩,被毛粗乱,摄食和饮水量减少,体重下降,后期出现极度消瘦,捧尿增多,临死前出现抽搐、侧脑等神经症状,此种临床表现一直持续至其死亡。
(2)低剂量感染组小鼠在染菌后,并未出现明显的精神不振,行动迟缓,被毛粗乱及体重的明显下降,但排尿较未染菌前增多。
(3)CY组小鼠,连续注射CY三天后,未出现明显的精神不振,行动迟缓,被毛粗乱,体重亦无下降,未出现抽搐等神经症状。
3.2.3外周血白细胞计数的变化:
(1)高剂量组小鼠在染菌后第4天外周血白细胞总数开始出现回升,与CY组有显著的统计学差异(P<0.05)。
(2)低剂量组小鼠在染菌后第4天外周血白细胞总数开始出现回升,与CY组无显著的统计学差异(P>0.05)。
3.2.4病理组织学观察结果:
(1)高剂量感染组小鼠肾脏HE和PAS染色结果:染菌后6hr,安乐死的小鼠,HE染色肾脏内出现以肾皮质内少量肾小体毛细血管球病变为主要特征的病理变化,病变程度轻微。PAS染色未见病原菌。染菌后第1天,安乐死小鼠,HE染色显示肾小体毛细血管球病变加重,充血出血、萎缩的肾小体增多;CP菌浸润的肾小体失去原有的结构,变成一片无结构物质,其内有大量的中性粒细胞、少量单核、嗜酸性粒细胞浸润。PAS染色可见肾小体及肾髓质内有数量不等的酵母型CP菌浸润。染菌后第4天,死亡小鼠HE染色显示肾间质内弥漫性充血出血,伴随以中性粒细胞为主的炎细胞浸润,形成真菌性脓肿,组织结构严重破坏;髓质弥漫性充血出血,结缔组织增生。PAS染色可见肾皮质和髓质内弥漫性酵母型及菌丝型CP菌浸润。染菌后第6天,死亡小鼠HE染色显示肾内出现大量融合性病灶,大部分的肾小体和肾小管被CP菌侵蚀破坏、溶解消失。PAS染色显示病灶内充满酵母型及菌丝型CP菌。
(2)高剂量感染组小鼠其他靶器官(肝、脑、脾、肺、心)HE和PAS染色典型病变:
①死亡小鼠左心室心肌出血,局部有灶性酵母型和菌丝型CP菌浸润,心肌细胞坏死,周围有炎细胞浸润,主要以多形核白细胞为主;
②死亡小鼠肝脏内可见大量肝细胞水样变,血窦扩张。肝小叶汇管区周围有少量的酵母型真菌浸润,肝细胞坏死,小叶间静脉内充满炎性渗出物;
③死亡小鼠肺脏内肺间质及肺泡少量出血,可见灶性酵母型和菌丝型CP菌浸润,周围有多形核白细胞浸润。
④死亡小鼠大脑内可见大脑皮质出血,周围有灶性酵母型和菌丝型CP菌浸润,并伴随中性粒细胞及小胶质细胞的浸润;
⑤死亡小鼠脾脏白髓内脾淋巴小结淋巴细胞减少,细胞呈空泡状.
(3)低剂量感染组小鼠主要靶器官HE和PAS染色结果:
该组小鼠其心、肝、脾、肺、肾、脑各脏器中,未见明显病理组织改变,主要靶器官肾脏内仅见极少数酵母型和菌丝型真菌在肾皮质内浸润,肾间质无充血出血,肾小体血管球无萎缩、变性、坏死,无明显的炎性渗出物。肾小管上皮细胞未出现明显的肿胀、脱落。肾组织内可见少量炎细胞浸润。
3.2.5靶器官组织动态载菌量分析结果:
实验期间,高剂量感染组小鼠在感染后第1天,在肾、心、肝、脑、肺、脾内可检测到CP菌,且以肾脏的载菌量最多,高达6.23±0.12,而肝脏载菌量最低,低达2.84±0.09;各个器官的载菌量大小依次为:肾>脑>肺>脾>心>肝。感染后第4天,各个主要脏器的载菌量达到最高峰,依然是肾脏的载菌量最多,高达8.29±0.13,而肝脏载菌量最低,达到3.63±0.49;感染后第6天,各个脏器载菌量又逐渐出现下降趋势。低剂量感染组在感染后第6天,才在各个主要脏器内检测到CP菌,且以肾脏的载菌量最多,高达3.74±0.43;脾脏载菌量最低,只有2.92±0.20。染菌后第7天至实验观察结束,未检测到CP菌。
3.2.6肾组织的细胞因子检测结果:
我们对免疫抑制小鼠CP菌感染形成的弥散性真菌病模型肾脏免疫细胞因子进行检测,实验结果显示,在染菌后第1天高低剂量组的IL-1,IL-6,IL-10,IL-12p70,TNF-α,IFN-Y,GM-CSF,IL-4各个细胞因子的变化与CY组的变化无显著性差异:染菌后第4天,高剂量组肾组织内8种细胞因子的分泌除了TNF-α的变化未见明显差异,其它因子的变化出现明显的差异。其中IL-4,IL-10,IL-12 p70,GM-CSF显示下降趋势;IL-1显示上升趋势;IL-6显示上升趋势后逐渐下降;IFN-γ显示稳定并逐渐下降趋势。低剂量组肾组织的8种细胞因子分泌维持稳定的变化,第12天后这些因子恢复到正常小鼠水平,但TNF-α在接种菌的第15天因子分泌水平仍未恢复到正常小鼠水平;观察至19天,IL-4的变化显示逐渐上升趋势。这种变化与CY组的变化一致。
3.2.7外周血细胞因子流式细胞术分析结果:
(1)正常小鼠外周血Th1/Th2细胞比率范围在3.92±1.50。在连续腹腔注射CY 3天后,Th1/Th2细胞比率出现明显下降,达2.08±1.42。
(2)染菌后,高剂量感染组小鼠外周血Th1/Th2细胞比率出现明显下降,持续至染菌后第6天,最低可达0.73±0.12,是正常小鼠外周血Th1/Th2细胞比率的1/5。
(3)染菌后,低剂量感染组小鼠外周血Th1/Th2细胞比率出现下降,持续至染菌后第6天,最低可达0.974±0.17,是正常小鼠外周血TH1/Th2细胞比率的1/4。染菌后第12天开始出现上升趋势,染菌后第15天,外周血Th1/Th2细胞比率出现明显的升高,高达6.08±2.46。
(4)CY组小鼠在连续腹腔注射CY 3天后,外周血TH1/Th2细胞比率出现明显下降,最低可达1.154±0.36。在第4天,逐渐出现上升趋势,持续至实验观察结束。
结论:
1.本实验通过严格控制CP菌菌体的形态及应用CY造成小鼠免疫抑制,为后期模型的建立奠定了基础。
2.本实验利用CY造成小鼠免疫抑制建立了CP菌弥散性多器官感染小鼠疾病动物模型。
3.本模型提供了弥散性CP菌感染小鼠模型的生存曲线、临床表现、外周血白细胞数、外周血Th1/Th2细胞比率变化、病理组织学变化、靶器官动态载菌量变化、肾组织的细胞因子变化。
4.模型病理组织学观察显示多器官弥散性真菌性脓肿形成的典型病理组织学改变;免疫学指标(外周血Th1/Th2细胞比率及肾组织的细胞因子检测)亦出现相应的变化。