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RNA处于中心法则的中心位置,从DNA获得遗传信息并传递给蛋白质,其在细胞各项生命活动中起到了至关重要的作用。早在半个世纪前就已经发现了RNA上存在多种化学修饰,至今这些化学修饰类型已经超过了一百种。2010年,科学家研究鉴定了与RNA上修饰相关的酶,发现RNA修饰是动态、可逆的,对基因的表达调控具有重要的作用。这些表观遗传修饰让我们能够从一个全新的转录层面去了解基因的表达和生命的一些基本过程。但是目前我们对RNA修饰的作用和功能还知之甚少。现有的相关研究手段仍然不够完善,比如方法的检测灵敏度不足,无法对稀有的样本开展研究和对低丰度的修饰核苷进行准确定量。因此需要开发新的方法来对RNA修饰进行深入的研究分析,包括准确定性、定量和定位分析。由于液相色谱-串联质谱联用方法选择性好、灵敏度高,定性和定量能力强,因此在本论文研究工作中,我们建立了样品前处理技术结合液相色谱-串联质谱联用的方法实现了对复杂样本中低丰度RNA修饰核苷的准确定性、定量分析;同时还建立了选择性酶切技术结合液相色谱-串联质谱联用的方法对mRNA中N7-甲基鸟嘌呤核苷修饰进行了探讨。1、建立了基于金属氧化物材料二氧化铈(Ce02)的分散固相萃取结合高效液相色谱-多反应监测-串联质谱联用(DSPE-HPLC-MRM-MS/MS)的分析方法用于人卵泡液中核糖核苷类代谢物的全分析。通过CeO2的选择性富集排除大量复杂基质干扰,提高了检测灵敏度,在人卵泡液中鉴定了 50种核糖核苷类代谢物。定量分析发现其中8种核糖核苷类代谢物的含量在多囊卵巢综合征(PCOS)患者的卵泡液和正常人卵泡液中具有显著性差异,可以作为PCOS疾病的潜在生物标志物。2、建立了金属氧化物材料选择性富集结合稳定同位素标记的双中性丢失扫描的质谱分析方法(DSPE-SIL-HPLC-DNLS-MS)用于人尿液中核糖核苷类代谢物的全分析。选择性富集和化学标记提高了方法的检测灵敏度,此外同位素标记的方法还提高了修饰核苷定性结果的可靠性。运用所建立的方法,在人尿液中鉴定了 49种核糖核苷类代谢物。定量分析发现其中7种核糖核苷类代谢物的含量在正常人和淋巴癌患者尿液中具有显著性差异,可以作为淋巴癌的潜在生物标志物。3、建立了差异核酸酶切技术结合液相色谱-串联质谱联用的方法分析真核生物mRNA内部N7-甲基鸟嘌呤核苷(m7G)。通过对一系列酶的筛选,发现S1核酸酶和蛇毒磷酸二酯酶对mRNA的5’端帽子结构酶切效率有显著性差别。利用这两个酶的酶切差异结合液相色谱-质谱联用分析,我们发现水稻,HeLa、293T、MCF-7细胞以及大鼠肝脏组织的mRNA内部均含有m7G修饰,其中水稻m7G含量最高。进一步研究发现镉胁迫可以造成mRNA中m7G含量的显著降低。综上,本论文研究工作建立了高灵敏的液相色谱-质谱联用分析方法,对RNA上的修饰核苷进行了定性、定量以及定位的研究,为深入认识RNA修饰的作用和生理功能提供了基础。