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硫化氢(H2S)作为包括一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)在内的气体信号分子家族的新成员,近年来受到了广泛的关注和系统的研究。H2S不仅可以参与动物的多种生理和病理过程,还具有调节植物生长发育和增强植物抗逆性的作用。H2S在体内主要通过一些酶促反应产生:在动物中,目前发现有三种酶与内源性H2S的产生有关,分别是胱硫醚γ-裂解酶(cystathionineγ-lyase,CSE)、胱硫醚β-合酶(cystathionineβ-synthase,CBS)和巯基丙酮酸硫转移酶(mercaptopyruvate sulphurtransferase,MST)。在植物中,目前发现的能够催化内源性H2S产生的酶有四类,分别是半胱氨酸脱巯基酶(cysteine desulphydrases,CDes)、半胱氨酸脱硫酶(cysteine desulfurases)、β-氰丙氨酸合酶(β-cyano-alanine cynthase,CAS)和O-乙酰丝氨酸硫醇裂解酶(O-acetylserine(thiol)lyase,OASTL)。其中,CBS、CSE、CDes、CAS、OASTL以及半胱氨酸脱硫酶都能以半胱氨酸(Cys)为底物催化动植物内源性H2S的产生,它们的相关酶学性质及底物特异性都已得到了系统的研究。目前关于植物中At MST也有很多功能研究,主要认为它是植物体内去氰毒过程中重要的酶。关于植物中At MST是否能催化产生H2S,没有任何报道。如果植物中At MST具有产生H2S的活性,那无疑是对气体信号分子H2S这一研究领域的一个重要补充。本文采用原核表达和体外纯化的方法,分析模式植物拟南芥中的At MST与H2S产生的关系,结果如下:1.表达载体的构建:经过NCBI网站比对,得到At MST(At1g79230)基因,网站显示其含有三个转录本,分别命名为At MST.1、At MST.2和At MST.3。以拟南芥c DNA为模板,克隆At MST(At1g79230)基因,将其连接到原核表达载体p ET28a上,得到重组的p ET28a-At MST质粒,其中At MST.2没有克隆成功,其余两个转录本测序鉴定正确,并成功转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞。2.原核表达诱导条件优化:将转化成功的BL21(DE3)/p ET28a-At MST经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,分别表达At MST.1和At MST.3蛋白,分子量分别为37.9k D和32.2k D,确定最佳的诱导条件为:IPTG终浓度为0.05mmol·l-1,20℃诱导培养20 h。3.蛋白纯化条件优化:将上述成功诱导的蛋白经Ni琼脂糖凝胶柱纯化,得到分子量为37.9k D的His-At MST.1重组蛋白,经过筛选,确定最佳的纯化条件为:20 mmol·l-1咪唑破碎菌体,50 mmol·l-1咪唑洗脱杂蛋白,300 mmol·l-1咪唑洗脱目的蛋白,经SDS-PAGE鉴定得到单一的目的蛋白条带;而分子量为32.2k D的His-At MST.3重组蛋白没有纯化成功。4.酶活测定:以巯基丙酮酸钠为底物,测定His-At MST.1催化H2S产生的速率,结果表明其具有催化H2S产生的活性;而未纯化成功的At MST.3蛋白,使用其全菌裂解液中的可溶性蛋白溶液进行酶活测定,同样检测到该蛋白可以以巯基丙酮酸钠为底物催化H2S的产生。综上所述,本研究通过对拟南芥MST的原核表达和酶活鉴定,确定其具有以巯基丙酮酸钠为底物,催化H2S产生的新功能。