研究目的本研究通过制备呋喃唑酮诱导的扩张型心肌病（Dilated Cardiomyopathy,DCM）大鼠模型,综合运用蛋白组学、代谢组学及网络药理学的研究方法,开展抗纤益心方治疗DCM的作用机制的研究,鉴定筛选DCM心肌组织差异蛋白及差异代谢物的表达概况,进行生物信息学分析,并结合网络药理学对抗纤益心方治疗DCM的潜在作用靶点分析,综合探讨抗纤益心方治疗DCM的作用机制,为抗纤益心方在临床的推广和应用提供更多依据。研究方法1.制备呋喃唑酮诱导的DCM大鼠模型,经抗纤益心方干预后,使用心脏超声技术评价心功能,通过HE染色观察心肌组织病理变化,通过Masson染色一步观察心肌组织纤维化程度,并结合透射电镜技术观察心肌组织超微结构。2.结合蛋白组学及代谢组学的研究方法,对DCM大鼠及抗纤益心方干预后后大鼠心肌组织进行分析鉴别筛选相关的差异蛋白和差异代谢物,进行生物信息学分析,探讨抗纤益心方治疗DCM的可能机制,进一步通过两组学间的数据联合分析其作用机制。3.基于网络药理学技术筛选出抗纤益心方总方与其“君臣佐使”不同配伍组分治疗DCM的潜在靶点,通过Metascape及String数据库对潜在的作用靶点进行功能富集分析,蛋白质互相作用的分析,阐述抗纤益心方的组方特点,揭示其治疗DCM的可能机制。4.应用Western Blot对筛选的关键差异蛋白的表达进行验证,探讨抗纤益心方治疗DCM的可能作用机制。研究结果1.使用呋喃唑酮制备DCM大鼠模型,经超声心动图检测发现,model组的左心室收缩末期内径（LVESD）和左心室舒张末内径（LVEDD）明显升高（P<0.01）,左心室缩短分数（LVFS）和左心室射血分数（LVEF）明显降低（P<0.01）,经抗纤益心方干预后上述指标均有改善（P<0.01）。通过观察病理学组织切片、Masson染色及心肌细胞超微结构发现,DCM心肌组织严重受损,细胞核排列不规则,部分细胞核固缩、碎裂,肌纤维排列疏松且紊乱;心肌纤维化明显增强;肌丝结构模糊,局部肌丝断裂,线粒体排列紊乱,线粒体肿胀伴空泡样变化。KXYX组经抗纤益心方干预后病理性形态结构明显改善。2.基于蛋白组学技术分析鉴定,model组与control组相比得到159个差异蛋白,其中42个表达上调,117个表达下调（unique peptide≥1,Fold Change>1.2或Fold Change<0.83,且p<0.05）。KXYX组与model组相比得到51个差异蛋白,其中34个表达上调,17个表达下调（unique peptide≥1,Fold Change>1.2或Fold Change<0.83,且p<0.05）。碳酸酐酶4（Ca4）、线粒体分裂因子（Mff）、线粒体硫双加氧酶（Ethe1）等差异蛋白在DCM中明显降低,经抗纤益心方干预后明显回调。通过生物信息学分析发现,3组间的差异蛋白的细胞定位主要集中在线粒体、细胞质内为主。差异蛋白的主要生物过程在model组比control中主要包括:能量代谢、钙离子反应、氧化还原、肌肉结构发育等;主要的分子功能包括细胞骨架蛋白结合、ATPase调节活性、含蛋白质复合物结合、氧化还原酶活性等。KXYX与model相比,差异蛋白主要的生物过程包括硫化合物代谢过程、细胞酰胺代谢过程、内质网介导高尔基体囊泡转运、细胞氨基酸代谢过程;主要的MF包括:催化活性、辅酶结合、胶原蛋白结合、NAD结合、肌动蛋白结合、氧化还原酶活性等。经KEGG富集通路分析发现,model比control主要富集通路包括扩张型心肌病通路（疾病通路）、心肌收缩通路、代谢通路、产热通路、内质网中蛋白质加工等通路。KXYX比model主要富集通路包括内质网中蛋白质加工、心肌收缩、氨基酸的生物合成、产热途径等通路。3.通过代谢组学分析,model组与control组相比得到113个差异代谢物,其中64个表达上调,49个表达下调（p<0.05,VIP>1）;KXYX组与model组相比得到140个差异代谢物,其中112个表达上调,28个表达下调（p<0.05,VIP>1）。通过分析发现,己二酸、亚油酸、左旋肉碱等27个差异代谢物在model组具有明显的下降或升高,经抗纤益心方干预后明显回调。在回调的代谢物中,经ROC曲线分析发现,model组对control组差异代谢物并且AUC>0.9的涉及6种差异代谢物,经过抗纤益心方干预后涉及10种差异代谢物。差异代谢物的通路分析显示,model组比control组主要涉及:氨基糖和核苷酸糖代谢、硫代谢、TCA循环、糖酵解和糖新生等通路。KXYX组对model组发现,抗纤益心方主要通过调节氨基酸合成与代谢、嘌呤代谢、硫代谢、苯丙氨酸代谢、TCA循环、亚油酸代谢等通路途径起到对DCM的治疗作用。4.通过蛋白组学和代谢组学联合分析发现,在model组比control的差异代谢物及差异蛋白涉及通路263条,主要是扩张型心肌病（疾病通路）、嘌呤代谢、硫代谢、碳代谢、糖酵解/糖异生、产热途径、氧化磷酸化、心肌收缩、钙信号通路、PI3K-Akt信号通路、Apelin信号通路、c AMP信号通路、醛固酮合成与分泌、肌动蛋白骨架的调控、c GMP-PKG信号通路、内质网蛋白加工、MAPK信号通路等。在KXYX组比model差异蛋白或代谢物涉及通路有77条,主要是嘌呤代谢、硫代谢、TCA循环、ABC转运蛋白、维生素消化吸收、氨基酸的生物合成、蛋白质消化吸收、产热途径、心肌收缩功能、内质网蛋白加工、c AMP信号等通路。综合分析差异蛋白及差异代谢物,抗纤益心方对硫代谢通路具有重要的调控作用。5.通过网络药理学筛选出抗纤益心方治疗DCM的91种潜在靶点,其“君臣佐使”各组分的靶点显示君药43种（47%）,臣药71种（77%）,臣药中有41种与君药靶点重复,佐药41种（45%）,使药12种（13%）。通过String数据库分析抗纤益心方得到生物过程1011种,分子功能133种,细胞组成84种,147条KEGG的相关通路,120种Reactome通路。通过Metascape将抗纤益心方蛋白功能关系密切的功能分类为20个子集,涉及722条作用途径,分别是血液循环、核受体转录途径、肌肉系统相关过程、活性氧的代谢过程等。抗纤益心方君药黄芪中有357条作用途径与总方完全相同,与总方相比有18个相同的功能子集,在抗纤益心方中占有最主要地位,臣药共有489条作用途径与总方完全相同,增强并补充了君药的作用机制。6.Western Blot验证差异蛋白Ca4、Ethe1、Mff、肌球蛋白轻链4（Myl4）、GTP结合蛋白（Sar1b）的表达,结果显示,与control比较,model组的Ca4、Ethe1、Mff、Sar1b蛋白表达量明显降低,其中Ca4、Ethe1、Mff差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。给予抗纤益心方干预后,Ca4、Ethe1、Mff、Sar1b蛋白表达量升高,其中Mff差异具有统计学意义（P<0.05）。与control比较,model组的Myl4蛋白表达量明显升高（P<0.01）,给予抗纤益心方干预后Myl4降低差异具有统计学意义（P<0.05）。这些差异蛋白可能是抗纤益心方治疗DCM的作用靶点,涉及功能主要与氧输送及CO2的可逆水合作用,线粒体分裂与融合、线粒体氧化磷酸化功能、内质网蛋白加工、心肌收缩有关。研究结论1.呋喃唑酮诱导的DCM大鼠模型心功能明显降低、心肌组织的形态结构受损、心肌纤维化程度明显增加、心肌线粒体超微结构损伤严重,抗纤益心方干预后可显著改善DCM大鼠心功能,缓解病理性形态结构改变,改善心肌纤维化,减轻线粒体损伤。2.使用蛋白组学研究技术,分析鉴定涉及DCM发展过程及抗纤益心方干预后的差异蛋白,通过生物信息学分析发现差异蛋白的细胞定位集中在线粒体与细胞内,揭示抗纤益心方的干预机制可能为调节能量代谢、硫代谢通路、内质网中蛋白质加工、心肌收缩功能、氨基酸的生物合成等途径。3.采用代谢组学研究技术,分析鉴定涉及DCM发展过程及抗纤益心方干预后的差异代谢物,经生物信息学分析,揭示抗纤益心方的干预机制可能为调节TCA循环、氨基酸合成与代谢、硫代谢、嘌呤代谢、亚油酸代谢等途径。4.从DCM大鼠心肌组织中鉴定筛选出51个差异蛋白,140个代谢物与抗纤益心方的干预机制相关,通过差异代谢物及蛋白联合分析,揭示了抗纤益心方作用机制涉及能量代谢、嘌呤代谢、氨基酸的生物合成、硫代谢、ABC转运蛋白、维生素消化吸收、产热途径、心肌收缩、内质网蛋白加工等通路。5.通过网络药理学研究发现,抗纤益心方通过调节血液循环、核受体转录途径、肌肉系统相关过程、活性氧的代谢过程、调节离子运输、调节激素水平、调控凋亡信号通路等发挥治疗DCM的作用。抗纤益心方治疗DCM的作用机制中,君药发挥主要作用,臣药增强补充了君药的作用。6.Western Blot验证Ca4、Ethe1、Mff、Myl4、Sar1b的表达与组学结果一致,这些差异蛋白可能是抗纤益心方的作用靶点,涉及功能主要与氧输送及CO2的可逆水合作用,线粒体分裂与融合、线粒体氧化磷酸化功能、内质网蛋白加工、心肌收缩功能有关。通过综合分析,抗纤益心方潜在的作用靶点主要集中在线粒体与细胞质内,其对线粒体功能的调节与线粒体融合分裂、线粒体生物合成、线粒体脂肪酸氧化、线粒体氧化磷酸化与维持离子稳态相关。抗纤益心方可通过调节能量代谢、线粒体功能、硫代谢、内质网蛋白加工、心肌收缩功能等途径发挥治疗DCM的作用。