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甲醇营养型巴斯德毕赤酵母作为真核表达系统,已越来越多的被用来表达外源蛋白。相比其他的表达系统,它不仅操作简单、适合高密度培养,同时,它表达的蛋白质能分泌且可溶,有糖基化等利于形成活性蛋白质的翻译后修饰。本研究就是在现行商品化的表达载体pPIC9k基础上,构建了一系列利于外源蛋白表达的新载体。本论文首先在pPIC9k的基础上,基于基因工程菌安全性、克隆方式等因素的考虑,构建了pHBM905A、pHBM905B、pHBM905D、pHBM905M一系列表达载体。首先将载体pPIC9k上的"Amp’+Ori"元件插入到HIS4基因序列中,使得外源基因整合入宿主基因组时缺乏抗性基因。然后将Kanr抗性基因作为填充片段插入到多克隆位点,并且在Kanr基因3’和5’端引入限制酶Not Ⅰ和Cpo Ⅰ识别位点,即得到载体pHBM905A。目的基因PCR产物以依赖于T4DNA聚合酶的3’-5’外切核酸酶活性的方式克隆该载体pHBM905A中。然后,d1+2×201AOX1启动子突变体替换载体pHBM905A上的AOX1启动子,得到新载体pHBM905D。随后,用人工合成根据毕赤酵母密码子偏爱性优化后的新信号肽MF4I-SS的编码序列替换载体pHBM905A中酿酒酵母MFa-SS信号肽编码序列,即得到新载体pHBM905B。再次,用MF4I-SS信号肽编码序列替换载体pHBM905D上的MFa-SS信号肽编码序列,即得到新载体pHBM905M。本论文在已构建好载体pHBM905M的基础上,基于Biobrick方法,构建了人工体外串联重复表达盒式结构多拷贝的新载体pHBM905BDM。先将载体pHBM905M上的Xba I识别位点突变,然后在外源基因表达盒式结构的5’和3’端分别加上EcoR I+Xba I和Spe I+BamH I识别位点。该载体的克隆方式同载体pHBM905M。重组质粒经过反复的酶切和连接,即可得到多个拷贝表达盒式结构串联重复的重组质粒。随后,将其线性化,转化毕赤酵母GS115感受态细胞,即可得到含有可控拷贝数的重组菌株。上述5种新载体,均得到了克隆和表达验证。结果表明,d1+2×201AOX1启动子和MF4I-SS信号肽具有协同效应,两者联合作用,在提高外源蛋白表达量方面,比单独作用有更强的效果。同时,在一定范围内,随着拷贝数的提高,外源蛋白的表达水平也随着提高。